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通过改进的向导 RNA 文库克隆实现紧凑型 CRISPR 基因筛选
背景 20 多年前，人类基因组计划产生了第一个组装的人类基因组 [1,2]。基因组测序工作揭示了与疾病相关的基因和遗传变异，但大部分并未揭示基因功能。因此，功能基因组学工作对于确定已鉴定的约 20,000 个人类蛋白质编码基因的功能至关重要。在过去十年中，基于 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）的筛选增加了全基因组遗传筛选的便利性，使研究人员能够发现生物途径的新成分、确定现有药物的机制、确定新的治疗靶点并揭示协同遗传关系 [3-7]。然而，由于全基因组向导文库的规模（20,000–200,000 + 个元素）和典型的细胞覆盖率（500–1000 倍）需要准确量化基因命中并平均整个群体中与表型无关的变异，每次筛选需要每个样本数千万到数亿个细胞 [ 8 – 12 ]。这一要求对需要大规模培养的细胞模型提出了后勤挑战
QIAGEN QIAseq FX DNA 文库试剂盒的自动化...
简介 文库制备是新一代测序 (NGS) 应用的关键要求，也是测序工作流程中最昂贵的部分之一。这不仅是一个耗时的步骤，而且还可能由于操作错误导致样本丢失或输出文库 DNA 质量下降。为了减少这些问题，简化的 QIAseq FX DNA 文库协议经过优化，可在酶促碎裂后直接进行接头连接，而无需中间清理步骤。此外，简单的协议（仅包含三个步骤）可确保在 Hamilton NGS STARlet 上顺利完成高优先级样本和低通量样本数量的文库制备自动化（图 1）。
一体化的文库制备工作流程
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使用全基因组 CRISPRi 筛选来探测遗传修饰因子的双 sgRNA 文库设计
© 作者 2023。开放存取 本文根据知识共享署名 4.0 国际许可进行授权，允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并指明是否做了更改。 本文中的图片或其他第三方资料包含在文章的知识共享许可中，除非资料的致谢中另有说明。 如果资料未包含在文章的知识共享许可中，且您的预期用途不被法定规定允许或超出允许用途，则需要直接从版权所有者处获得许可。 要查看此许可证的副本，请访问 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。知识共享公共领域贡献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非数据来源中另有说明。
NEBNext UltraExpress DNA 文库制备试剂盒 E3325 手册
NEBNext UltraExpress DNA 文库制备试剂盒包含所需的酶和缓冲液，可将 10-200 ng DNA 快速转化为高质量文库，以便在 Illumina 平台上进行测序。快速、简单的工作流程减少了清理步骤，最大程度地缩短了手动操作时间，并允许在整个输入范围内使用单一接头稀释度和 PCR 循环条件。该方案还允许在单个试管中制备文库，从而最大限度地减少塑料耗材浪费。除了标准方案外，还包含一个附录，其中详细介绍了针对不同 DNA 输入量的定制接头和循环建议，如果需要进一步优化文库产量。
A39097096 Collibri™ ES DNA 文库制备试剂盒（含 PCR MM）包装批号：2818863 有效期：2024 年 9 月 30 日（DD.MM.YYYY）储存温度：-20±5°C
批次 数量 描述 2791569 2 x 1.25 mL 2x Platinum™ SuperFi™ 文库扩增预混液 2806274 500 µL 10x 片段化和 dA 加尾缓冲液 2805059 1 mL 5x 片段化和 dA 加尾酶混合物 2806270 1 mL 7x 连接预混液 2803108 2 x 500 µL 引物混合物
Watchmaker DNA 文库制备试剂盒在 Revvity Sciclone G3 NGSx 工作站上实现自动碎片化。
图 1：在 Sciclone G3 NGSx 工作站上，Watchmaker® DNA 文库制备试剂盒的自动化流程。96 个样本的总处理时间（包括试剂和平台设置）在 3.5 到 4.5 小时之间，具体取决于 Frag/AT 和 PCR 参数。所有自动化步骤都标为紫色，手动干预标为粉色。
使用 Covaris® 进行自动化 NGS 文库制备
为了证明此工作流程的效率和多功能性，使用 Covaris® LE220-plus 聚焦超声波发生器在 96 microTUBE™ AFA™ 纤维板中剪切 DNA 样本。然后从仪器中取出板并放置在 Sciclone G3 NGSx 工作站上可手动安装的板适配器下，如图 4 所示。使用 Revvity LabChip® GX Touch™ 核酸分析仪分析分子量
从碎片 DNA 中制备 Onso 文库以用于短...
对于每个样本，从步骤 4b.15 中取出 2 µL PCR 扩增文库进行定量分析：接下来必须按照“Onso TM 文库的 qPCR 定量分析”程序使用 Onso Library 定量试剂盒 (PacBio 102-431-800) 通过 qPCR 准确评估文库数量。这将确保在簇生成期间能够实现最佳簇密度。注意：步骤 4b.17 可以与步骤 4b.16 同时进行。
