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热点-让定向进化更简单 摘要
定向进化已成为一种设计蛋白质各种特性的有力策略。传统的构建文库的方法，如易错的 PCR 和 DNA 改组，通常会产生庞大且效率相对较低的文库。在缺乏高通量筛选方法的情况下，搜索此类文库既费时又费力，而且成本高昂。另一方面，由结构或序列信息引导的定向诱变已成为一种产生所谓智能文库的流行方法。随着有利突变与有害突变比例的增加，智能文库可提高定向进化的效率，前提是靶位预测可靠。突变靶位或热点预测对文库的质量和定向进化的性能至关重要。适当选择热点可以高效合理地生成具有所需特性的蛋白质。本文概述了七种热点，分为两类：基于序列的热点，包括 CbD（保守但不同）位点和共同进化的残基；基于 3D 结构的热点，包括活性位点残基、通道位点、柔性位点、与活性中心偶联的远端位点和界面位点。本综述还介绍了用于识别这些热点的计算工具的最新进展，以及将它们用于酶工程的许多成功案例。
IDT xGen DNA Library Prep EZ Kit 和 xGen DNA Library Prep EZ UNI Kit 方案 (RUO21-0413_002 06/24)
xGen DNA 文库制备 EZ 试剂盒简化了 NGS 样本制备，用于在 Illumina ® 平台上进行测序。该试剂盒提供快速 DNA 片段化和文库构建，以生成用于测序的文库（图 1）。提供了获取 350bp 或 200bp 平均比对插入片段的详细说明，用于直接或靶向测序。针对更大的插入片段大小（最多 550 bp），提供了协议修订版，以指导您使用 xGen 减速模块。
QIAGEN 推出全新文库制备试剂盒，助力多组学研究并推进精准医疗
研究人员还可以使用 QIAseq 多模态 DNA/RNA 文库试剂盒生成仅含 DNA 或仅含 RNA 的文库。这是市场上第一款可兼容多种输入样本的 NGS 多模态试剂盒，包括血液、福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本和无细胞 DNA (cfDNA)。这在转化研究中尤其重要，例如在癌症研究中，可能会有不同类型的样本。该试剂盒灵敏度高，可检测 DNA 和 RNA 稀有变异。使用 QIAseq 多模态 DNA/RNA 文库试剂盒生成的 DNA 和 RNA 文库可直接与不同的测序平台兼容，例如 Illumina 仪器和 Element Aviti，并且可以通过增加转换步骤在其他测序仪上进行测序（Complete Genomics/MGI、Singular Genomics 和 Ultima Genomics）。
2024 年 CBER 科学研讨会海报摘要
评估 RNA 提取和 Illumina NGS 文库制备方法以从不同样本基质中检测病毒 RNA Sayma Afroj 1、Aaron Scholl 1、Binsheng Gong 2、Bingjie Li 1、Joshua Xu 2 和 Sandip De 1 * 1 美国食品药品管理局治疗产品办公室细胞治疗和人体组织办公室细胞治疗部 2 司肿瘤疫苗和生物技术处，10903 New Hampshire Avenue，Silver Spring，MD，20993；2 美国食品药品管理局国家毒理学研究中心生物信息学和生物统计学部 3900 NCTR Rd Jefferson，AR 72079。目标：当前的病原体和外来因子检测试验面临局限性，例如对某些病原体的特异性和灵敏度降低，这对 HCT/Ps 的安全使用提出了挑战。该项目旨在评估各种 RNA 提取和 NGS 文库制备方法，以实现对病原体和外来因子的快速、广泛、灵敏和特异性检测。方法：我们使用三种研究设计来评估 RNA 提取方法：将寨卡病毒 (ZIKV) 注入幼稚细胞、使用持续感染 ZIKV 的细胞系以及将持续感染的 ZIKV 细胞注入白膜样本。使用五种方法提取 RNA，并使用 qRT-PCR 对 ZIKV 进行定量分析。为了评估 RNA 文库制备方法，我们将病毒组 HEV RR.1 和 BEI-NR-59622（包含 PCV1、Reo、FeLV、RSV、EBV）注入 U937 细胞，提取总 RNA，并使用各种商业试剂盒和组合构建文库。这些文库在 Illumina NovaSeq 6000 平台上进行测序。正在分析 NGS 数据以确定病毒基因组图谱、基因组覆盖率和映射读取的百分比。结果与结论：总体而言，硅胶柱纯化的 TRIzol 提取被证明是提取病毒 RNA 的最佳方法。正如预期的那样，我们观察到不同的 NGS 文库制备方法之间存在显著差异。rRNA 耗竭有效减少了 NGS 文库中的人类 rRNA。正在进行进一步的数据分析，以研究各种文库制备方法对参考病毒 RNA 产生的 NGS 读数总数的影响。简明语言摘要：有效的病毒核酸提取和文库制备方法对于使用 NGS 技术从细胞和组织中检测不定病毒以及确保细胞和组织治疗的安全性至关重要。我们的研究评估了几种 RNA 提取方法，并观察到测试方法中病毒 RNA 提取效率的差异。总体而言，硅胶柱纯化的 TRIzol 是跨测试样本基质检测病毒最灵敏的方法。正如预期的那样，我们观察到不同的 NGS 文库制备方法之间存在显著差异。正在进行进一步的数据分析，以研究各种文库制备方法对参考病毒 RNA 产生的 NGS 读数总数的影响。
在微生物 CRISPR 干扰中使用缩短和随机 sgRNA 文库筛选新靶基因
摘要：CRISPR 干扰（CRISPRi）筛选已用于使用单分子向导 RNA（sgRNA）文库识别与特定表型相关的靶基因。在 CRISPRi 筛选中，包含原始靶标识别序列的随机 sgRNA 文库的大小很大（∼ 10 12 ）。在本文中，我们证明 sgRNA 中的靶标识别序列（TRS）的长度可以从原来的 20 个核苷酸（N 20 ）缩短到 9 个核苷酸（N 9 ），这仍然足以使 dCas9 抑制大肠杆菌木糖操纵子中的靶基因，无论其与启动子还是开放阅读框区结合。基于结果，我们构建了 TRS 长度 5′ 缩短的随机 sgRNA 质粒文库，并通过对从 Xyl − 表型细胞中纯化的 sgRNA 质粒进行桑格测序来识别木糖代谢靶基因。接下来，利用随机 sgRNA 文库筛选靶基因，以增强合成大肠杆菌细胞中紫色素的产生。通过分析深紫色菌落中 sgRNA 质粒中的 TRS 冗余度，选择了 17 个靶基因。其中，已知有 7 个基因（tyrR、pykF、cra、ptsG、pykA、sdaA 和 tnaA）可增加细胞内 L-色氨酸池（紫色素的前体）。17 个细胞中每个靶基因有一个缺失，紫色素的产量显著增加。这些结果表明，使用缩短的随机 TRS 文库进行 CRISPRi 可以简单且经济高效地进行基于表型的靶基因筛选。关键词：CRISPR 干扰、失活 Cas9、随机文库、缩短的 sgRNA、靶标识别序列、紫色素、基于表型的靶标筛选■简介
DNA编码的化学文库产生非共价和非肽SARS-COV-2主要蛋白酶抑制剂
1美国贝勒医学院病理与免疫学系的药物发现中心，美国德克萨斯州休斯敦77030，美国。2 Verna和Marrs McLean生物化学与分子药理学系，贝勒医学院，德克萨斯州休斯敦77030，美国。3，明尼苏达州明尼阿波利斯，明尼苏达州，明尼苏达州，分子生物学和生物物理学系，分子生物学和生物物理学，美国明尼苏达州55455，美国。4美国贝勒医学院国家热带医学院儿科系，美国德克萨斯州休斯敦77030。 5美国德克萨斯州贝茨街1102号，德克萨斯州休斯敦市贝茨街1102号疫苗开发中心，美国德克萨斯州77030，美国。 6伯克利结构生物学中心分子生物物理学和综合生物成像，劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利94720，美国。 7，德克萨斯大学圣安东尼奥大学生物化学与结构生物学系，德克萨斯州圣安东尼奥市，美国78229，美国。 8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。 9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。 10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。 ✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu4美国贝勒医学院国家热带医学院儿科系，美国德克萨斯州休斯敦77030。5美国德克萨斯州贝茨街1102号，德克萨斯州休斯敦市贝茨街1102号疫苗开发中心，美国德克萨斯州77030，美国。 6伯克利结构生物学中心分子生物物理学和综合生物成像，劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利94720，美国。 7，德克萨斯大学圣安东尼奥大学生物化学与结构生物学系，德克萨斯州圣安东尼奥市，美国78229，美国。 8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。 9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。 10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。 ✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu5美国德克萨斯州贝茨街1102号，德克萨斯州休斯敦市贝茨街1102号疫苗开发中心，美国德克萨斯州77030，美国。6伯克利结构生物学中心分子生物物理学和综合生物成像，劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利94720，美国。7，德克萨斯大学圣安东尼奥大学生物化学与结构生物学系，德克萨斯州圣安东尼奥市，美国78229，美国。8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。 9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。 10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。 ✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu
利用酵母表面展示进行原生动物病原体药物靶标筛选的全基因组文库
1 加拿大魁北克省圣安妮贝尔维尤麦吉尔大学寄生虫学研究所 H9X 3V9 2 加拿大魁北克省蒙特利尔麦吉尔大学实验医学部 H4A 3J1 3 法国图尔药学院 Monge 大道 31 号 37200
N-甲基-N-亚硝脲诱变受精卵细胞引起的水稻突变体文库成员的全基因组测序
摘要 尽管靶向基因组编辑技术已成为加速功能基因组学的有力反向遗传方法，但由化学诱变剂诱导的传统突变体文库对于植物研究仍然很有价值。含有化学诱导突变的植物是简单而有效的遗传工具，可以在不考虑生物安全问题的情况下种植。突变体个体的全基因组测序减少了突变体筛选所需的工作量，从而提高了它们的实用性。在本研究中，我们对由用 N-甲基-N-亚硝脲 (MNU) 处理单个受精卵细胞而获得的 Oryza sativa cv. Nipponbare 突变体文库成员进行了测序。通过对该突变体文库中的 266 株 M 1 植物进行全基因组测序，我们总共鉴定出 66 万个诱导点突变。这个结果代表了 373 Mb 组装水稻基因组中每 146 kb 基因组序列中有一个突变。这些点突变均匀分布于整个水稻基因组中，超过 70,000 个点突变位于编码序列内。尽管该突变体文库规模较小，但近 61% 的所有注释水稻基因中均发现了非同义突变，8.6%（3248 个基因）的点突变对基因功能有较大影响，例如获得终止密码子或丢失起始密码子。WGS 表明使用水稻受精卵细胞的 MNU 诱变可有效诱导突变，适用于构建用于计算机突变体筛选系统的突变体文库。扩展该突变体文库及其数据库将提供一种有用的计算机筛选工具，以促进功能基因组学研究，特别是针对水稻。关键词：水稻突变体文库、N-甲基-N-亚硝脲 (MNU)、单核苷酸变体 (SNV)、NGS、计算机 TILLING、水稻、全基因组测序、遗传资源
使用全基因组 CRISPRi 筛选来探测遗传修饰因子的双 sgRNA 文库设计
© 作者 2023。开放存取 本文根据知识共享署名 4.0 国际许可进行授权，允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并指明是否做了更改。 本文中的图片或其他第三方资料包含在文章的知识共享许可中，除非资料的致谢中另有说明。 如果资料未包含在文章的知识共享许可中，且您的预期用途不被法定规定允许或超出允许用途，则需要直接从版权所有者处获得许可。 要查看此许可证的副本，请访问 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。知识共享公共领域贡献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非数据来源中另有说明。
DNA编码的化学文库产生非共价和非肽SARS-COV-2主要蛋白酶抑制剂
1美国贝勒医学院病理与免疫学系的药物发现中心，美国德克萨斯州休斯敦77030，美国。2 Verna和Marrs McLean生物化学与分子药理学系，贝勒医学院，德克萨斯州休斯敦77030，美国。3，明尼苏达州明尼阿波利斯，明尼苏达州，明尼苏达州，分子生物学和生物物理学系，分子生物学和生物物理学，美国明尼苏达州55455，美国。4美国贝勒医学院国家热带医学院儿科系，美国德克萨斯州休斯敦77030。 5美国德克萨斯州贝茨街1102号，德克萨斯州休斯敦市贝茨街1102号疫苗开发中心，美国德克萨斯州77030，美国。 6伯克利结构生物学中心分子生物物理学和综合生物成像，劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利94720，美国。 7，德克萨斯大学圣安东尼奥大学生物化学与结构生物学系，德克萨斯州圣安东尼奥市，美国78229，美国。 8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。 9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。 10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。 ✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu4美国贝勒医学院国家热带医学院儿科系，美国德克萨斯州休斯敦77030。5美国德克萨斯州贝茨街1102号，德克萨斯州休斯敦市贝茨街1102号疫苗开发中心，美国德克萨斯州77030，美国。 6伯克利结构生物学中心分子生物物理学和综合生物成像，劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利94720，美国。 7，德克萨斯大学圣安东尼奥大学生物化学与结构生物学系，德克萨斯州圣安东尼奥市，美国78229，美国。 8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。 9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。 10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。 ✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu5美国德克萨斯州贝茨街1102号，德克萨斯州休斯敦市贝茨街1102号疫苗开发中心，美国德克萨斯州77030，美国。6伯克利结构生物学中心分子生物物理学和综合生物成像，劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利94720，美国。7，德克萨斯大学圣安东尼奥大学生物化学与结构生物学系，德克萨斯州圣安东尼奥市，美国78229，美国。8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。 9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。 10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。 ✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu8霍华德·休斯医学院，德克萨斯大学健康圣安东尼奥分校，圣安东尼奥，德克萨斯州78229，美国。9这些作者同样贡献：Ravikumar Jimmidi，Srinivas Chamakuri，Shuo Lu。10这些作者共同监督这项工作：Srinivas Chamakuri，Timothy Palzkill，Damian W. Young。✉电子邮件：srinivas.chamakuri@bcm.edu; timothyp@bcm.edu; damian.young@bcm.edu