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使用 Illumina Cell-Free DNA Prep with Enrichment 检测 FFPE 肿瘤样本中的罕见体细胞变异
将组织活检基因组分析的结果与补充液体活检数据相结合，可以全面了解肿瘤生物学。Illumina Cell-Free DNA Prep with Enrichment 是一种多功能文库制备试剂盒，可用于从循环无细胞 DNA (cfDNA) 或从 FFPE 组织样本中提取的基因组 DNA (gDNA) 制备可用于测序的文库 (图 1)。该工作流程包括用于纠正错误和减少假阳性的唯一分子标识符 (UMI)，从而能够准确、灵敏地检测 FFPE 肿瘤样本中的低频突变。Illumina Cell-Free DNA Prep with Enrichment 与 Illumina 和第三方富集探针或面板兼容，以支持灵活的实验设计。本应用说明展示了 Illumina Cell-Free DNA Prep with Enrichment 在生成高质量 NGS 文库和从 FFPE 样本中鉴定低频体细胞变异方面的优异性能。
系统性多性状 AAV 衣壳工程实现高效基因传递
扩大基因治疗应用需要可制造的载体，这些载体可以有效地传导人类和临床前模型中的靶细胞。传统的腺相关病毒 (AAV) 衣壳文库选择方法无法在广阔的序列空间中搜索一小部分具有临床转化所必需的多种性状的载体。在这里，我们介绍了 Fit4-Function，这是一种可通用的机器学习 (ML) 方法，用于系统地设计多性状 AAV 衣壳。通过利用均匀采样可制造序列空间的衣壳文库，可以生成可重复的筛选数据来训练准确的序列到功能模型。结合六种模型，我们设计了一个多性状（肝脏靶向、可制造）衣壳文库，并根据所有六个预定标准验证了 88% 的文库变体。此外，仅使用小鼠体内和人类体外 Fit4Function 数据进行训练的模型准确预测了 AAV 衣壳变体在恒河猴中的生物分布。顶级候选物表现出与 AAV9 相当的生产产量、高效的小鼠肝脏转导、高达 1000 倍的人类肝细胞转导以及在恒河猴肝脏转导筛选中相对于 AAV9 的富集度增加。Fit4Function 策略最终使得预测肽修饰 AAV 衣壳的跨物种性状成为可能，并且是组装预测 AAV 衣壳在数十种性状中表现的 ML 图谱的关键一步。
构建，管理和分析质粒库的最终指南
例如，要研究基因在疾病模型中的作用，您可以构建由基因的各种功能域或具有缺失域和靶向突变的变体组成的质粒文库。以这种方式，您可以破译该基因的生物学作用，基因的功能结构域以及与该基因功能相关的关键氨基酸残基。此外，您可以根据正在从事的不同项目以及用于制备质粒DNA的过程（研究与临床等级材料或简单的DNA Prep与哺乳动物细胞的无内毒素质粒准备）创建质粒文库。
NEXTFLEX® 快速 DNA 测序试剂盒 2.0 (1 ng
NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit 2.0 专为约 3 小时构建 DNA 文库而设计，包含 1 ng – 1 µg 碎片 DNA。此试剂盒不推荐用于 FFPE 样本。该试剂盒可用于使用 Illumina® 和 Element® 平台为单端或双端测序准备多路复用文库。此外，多达 1536 个独特适配器条形码的可用性有助于实现高通量应用。如果执行定量测序应用（如检测低频变异或罕见体细胞突变），请考虑使用我们的 NEXTFLEX® UDI-UMI 条形码。
Watchmaker DNA 文库制备试剂盒在 Revvity Sciclone G3 NGSx 工作站上实现自动碎片化。
图 1：在 Sciclone G3 NGSx 工作站上，Watchmaker® DNA 文库制备试剂盒的自动化流程。96 个样本的总处理时间（包括试剂和平台设置）在 3.5 到 4.5 小时之间，具体取决于 Frag/AT 和 PCR 参数。所有自动化步骤都标为紫色，手动干预标为粉色。
CUTANA™ 止动缓冲液
CUT&RUN 方法 CUT&RUN 使用 CUTANA™ChIC/CUT&RUN 试剂盒进行，起始于 500k K562 细胞，含 0.5 µg IgG（EpiCypher 13-0042）、H3K4me3（EpiCypher 13-0060）、H3K27me3（EpiCypher 13-0055）或 0.125 µg CTCF（EpiCypher 13-2014）抗体，一式两份。使用 CUTANA™CUT&RUN 文库制备试剂盒（EpiCypher 14-1001/14-1002）以 5 ng DNA（或回收总量，如果少于 5 ng）进行文库制备。文库在 Illumina NextSeq2000 上运行，采用双端测序（2x50 bp）。样本测序深度为 5.5/18.8 百万个读数 (IgG Rep 1/Rep 2)、14.2/17.0 百万个读数 (H3K4me3 Rep 1/Rep 2)、24.7/18.1 百万个读数 (H3K27me3 Rep 1/Rep 2) 和 8.6/5.5 百万个读数 (CTCF Rep 1/Rep 2)。使用 Bowtie2 将数据与 T2T-CHM13v2.0 基因组比对。过滤数据以删除重复、多比对读数和 ENCODE DAC 排除列表区域。
Eurofins基因组学样本提交指南
可用于分离DNA（例如Qiagen dneasy套件）。研究人员应选择满足其特定需求的协议。有机提取方法（例如苯酚或Trizol）不应用于纯化总DNA，因为它们可以抑制文库制备过程中使用的酶，因此增加了文库制备失败的风险。如果使用基于苯酚或Trizol的方法是不可避免的（例如，要获得高分子DNA），应保证这些化合物的总去除（这意味着需要在提取后需要额外的清理步骤）。•为了获得最佳结果，请使用已快速冷冻的新鲜样品或样品
超有效的自动化整个基因组测序：使用QIASEQ®FXDNA库套件和Qiaseq®normalizer套件的图书馆准备工作流程
图5。QIASEQ归一化器从具有不同输入DNA浓度的样品批次产生可重复的，归一化的DNA文库。为了证明这一点，我们创建了一批24个样本的e.coli DNA，范围为10至100 ng输入（CV = 64.67％）。我们使用QIASEQ FX PLUS QIASEQ归一化器（Workflow B）处理了样品，在库准备后，我们在归一化之前和之后删除了等分试样。归一化器产生的文库具有适当的测序浓度（平均1.8 ng/μl）和库浓度降低（CV从33.85％降低至13.53％）。
使用 Enrichment Dx 进行 Illumina DNA 制备
Illumina DNA Prep with Enrichment Dx 是一种文库制备和富集解决方案，符合欧盟 (EU) 关于体外诊断医疗器械的法规 2017/746，并受美国食品药品管理局 (FDA) 监管。它支持来自人体细胞和组织的各种基因组 DNA (gDNA) 的文库制备，包括从全血或福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 组织中提取的 gDNA（表 1）。作为下一代测序 (NGS) 工作流程的一部分，Illumina DNA Prep with Enrichment Dx 使临床实验室能够将有针对性的测序富集面板添加到其诊断应用程序中（图 1）。
DDX3X 的饱和基因组编辑阐明了生殖系和体细胞变异的致病性
图 1 实验设计 A) 对于每个外显子，在 5' 和 3' 端设计两个独立的 sgRNA 和相关的 HDR 变体文库。B) 将 sgRNA 和 HDR 变体文库一起转染到表达 LIG4 -KO Cas9 的 HAP1 细胞中。sgRNA 指导 Cas9 介导的双链 DNA 切割到目标外显子。HDR 利用质粒文库作为修复模板，将单个感兴趣的 DDX3X 变体整合到每个细胞的内源位点中。每个供体模板还携带 1-3 个 NGG PAM 位点和原型间隔物的同义变化，防止重新切割。由于 DDX3X 是必需的，消除基因功能的变体会导致这些细胞死亡。我们在第 4、7、11、15 和 21 天对细胞进行取样，并对基因组 DNA 进行深度测序以量化变体的丰度。我们预计功能性错义（紫色）和同义变体（Syn，蓝色）仍然丰富，而功能丧失变体（LOF，红色）和有害错义（黄色）变体将从培养物中耗尽。