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Slr1-d7 和 ... 的生成和转录组分析
摘要：水稻SLR1基因编码DELLA蛋白（具有DELLA氨基酸基序的蛋白质），其功能丧失突变通过抑制植物生长而使植物矮化。我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在水稻中靶向突变DELLA/TVHYNP结构域，生成具有半显性矮化表型的slr1-d突变体。在31株转基因植株中获得了16个遗传编辑株系。深度测序结果表明，突变体在SLR1基因的TVHYNP结构域靶位点有6种不同的突变类型。同源编辑植株在T1代中选择了没有通过分离转录的T-DNA（T-DNA）的个体。slr1-d7和slr1-d8植株导致对赤霉素（GA）不敏感的矮化表型，叶片皱缩，节间缩短。通过 RNA-seq 进行的全基因组基因表达分析表明，在编辑的突变体植物中，两个与 GA 相关的基因 GA 20 OX 2（赤霉素氧化酶）和 GA 3 OX 2 的表达水平有所增加，这表明 GA 20 OX 2 充当了 GA 12 信号的转换器。这些突变体植物需要改变 GA 反应，至少部分是由于植物激素信号系统过程的缺陷，并阻止了细胞伸长。新的突变体，即 slr1-d7 和 slr1-d8 系，是有价值的半显性矮化等位基因，具有利用 CRISPR / Cas9 系统在水稻中进行分子育种的潜在应用价值。
CRISPR/Cas9 基因组编辑马铃薯 StDMR6-1 可使植物受不同胁迫条件的影响更小
马铃薯是第三大重要粮食作物，但种植面临众多疾病和不利的非生物条件的挑战。为了对抗疾病，经常使用杀菌剂是很常见的。通过基因组编辑敲除易感基因可能是提高抗性的持久选择。DMR6 已被描述为几种作物中的易感基因，根据数据显示，基因功能中断后抗性增加。在马铃薯中，Stdmr6-1 突变体已被描述为在受控条件下对晚疫病病原菌 Phytophthora infestans 具有更高的抗性。在这里，我们展示了连续四年在 P. infestans 种群复杂的地区对 CRISPR/Cas9 突变体进行的田间评估，结果表明对晚疫病的抗性增强，而不会影响产量或块茎质量。此外，对田间试验中马铃薯块茎的研究表明，对普通疮痂病的抗性增强，突变株系在受控条件下表现出对早疫病病原菌 Alternaria solani 的抗性增强。早疫病和疮痂病是马铃薯抗性育种中难以攻克的病害，因为抗性基因非常稀少。Stdmr6-1 突变体所描述的广谱抗性可能进一步扩展到某些非生物胁迫条件。在干旱模拟或盐度的受控实验中，Stdmr6-1 突变体植物受到的影响小于背景品种。总之，这些结果表明 Stdmr6-1 突变体有望成为未来可持续马铃薯种植的有用工具，且没有任何明显的权衡。
CRISPR/Cas9 基因组编辑马铃薯 StDMR6-1 可使植物受不同胁迫条件的影响更小
马铃薯是第三大重要粮食作物，但种植面临众多疾病和不利的非生物条件的挑战。为了对抗疾病，经常使用杀菌剂是很常见的。通过基因组编辑敲除易感基因可能是提高抗性的持久选择。DMR6 已被描述为几种作物中的易感基因，根据数据显示，基因功能中断后抗性增加。在马铃薯中，Stdmr6-1 突变体已被描述为在受控条件下对晚疫病病原菌 Phytophthora infestans 具有更高的抗性。在这里，我们展示了连续四年在 P. infestans 种群复杂的地区对 CRISPR/Cas9 突变体进行的田间评估，结果表明对晚疫病的抗性增强，而不会影响产量或块茎质量。此外，对田间试验中马铃薯块茎的研究表明，对普通疮痂病的抗性增强，突变株系在受控条件下表现出对早疫病病原菌 Alternaria solani 的抗性增强。早疫病和疮痂病是马铃薯抗性育种中难以攻克的病害，因为抗性基因非常稀少。Stdmr6-1 突变体所描述的广谱抗性可能进一步扩展到某些非生物胁迫条件。在干旱模拟或盐度的受控实验中，Stdmr6-1 突变体植物受到的影响小于背景品种。总之，这些结果表明 Stdmr6-1 突变体有望成为未来可持续马铃薯种植的有用工具，且没有任何明显的权衡。
通过 CRISPR/ 增强对稻瘟病的抵抗力...
稻瘟病是影响全球水稻生产的最常见的破坏性疾病。宿主生物的抗性已成为控制稻瘟病最实用、最经济的方法。最近的研究表明，序列特异性核酸酶（有规律地聚集在一起）间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 技术被认为是通过基因特异性基因组编辑增强作物的最成功和最有效的工具。然而，关于它们在改良优良水稻品种方面的应用报道并不多。在本研究中，我们描述了 Cas9-OsHDT-sgRNA 表达基因盒的开发，该基因盒靶向水稻中的 OsHDT701 基因并提高水稻的稻瘟病抗性。根据 Sanger 测序方法，这些植物的目标位置发生了缺失 (Del) 改变。我们证明，具有预期基因改变但没有移植 DNA 的突变系显示 OsHDT701 基因诱导的等位基因突变。用 M13 引物确认重组克隆。在突变纯合植物中，对植物的高度、大小、形状、叶片长度、穗长和叶片反应等表型和农艺性状进行了检查，以确定其抗稻瘟病性。与野生型植物相比，所有突变株系因病原体感染而引起的稻瘟病病变明显减少。此外，从外观上看，突变植物和野生植物在农艺性状方面没有显著差异。我们的研究结果表明，CRISPR/Cas9 基因编辑系统是一种增强水稻抗稻瘟病性的实用方法。
编辑甜瓜 eIF4E 与抗病毒和雄性不育有关
摘要 帽结合蛋白 eIF4E 通过与 eIF4G 相互作用构成 eIF4F 复合物的核心，该复合物在 mRNA 的环化及其随后的帽依赖性翻译中起关键作用。除了在 mRNA 翻译起始中的基本作用外，还描述或提出了 eIF4E 的其他功能，包括充当前病毒因子和参与性发育。我们使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑生成了甜瓜 eif4e 敲除突变株系。编辑在甜瓜中有效，因为我们在 T0 代就获得了第一个 eIF4E 外显子中单核苷酸纯合缺失的转化植物。分离 F2 代的编辑和非转基因植物接种了摩洛哥西瓜花叶病毒 (MWMV)；纯合突变植物表现出病毒抗性，而杂合和非突变植物被感染，这与我们之前对 eIF4E 沉默植物的结果一致。有趣的是，T0 和 F2 代的所有纯合编辑植物都表现出雄性不育表型，而与野生型植物杂交则恢复了育性，表明雄性不育表型的分离与 eif4e 突变的分离之间存在完美的相关性。对甜瓜雄花沿连续发育阶段的形态学比较分析表明，小孢子母细胞和绒毡层在减数分裂后发育异常，突变体和野生型的绒毡层降解时间明显不同。RNA-Seq 分析确定了花粉发育中的关键基因，这些基因在 eif4e/eif4e 植物的花中下调，并表明 eIF4E 特异性 mRNA 翻译起始是甜瓜雄配子形成的限制因素。
CRISPR/Cas9 介导的 AGAMOUS 样基因编辑导致大白菜 (Brassica rapa ssp. pekinensis) 出现晚熟表型
摘要：由于春季气温突变，大白菜这种食用叶菜类蔬菜会因抽薹而失去其商业价值，即从营养生长转变为生殖生长的现象。在本研究中，我们应用成簇的规律间隔的短回文重复序列/(CRISPR) 相关系统 9 (CRISPR/Cas9) 技术来分析 AGAMOUS 样基因。我们利用 CRISPR/Cas9 介导的大白菜转化技术对与抽薹和开花相关的 AGL19 和 AGL24 基因进行了功能分析。我们创建了脱靶概率低的单向导 RNA (sgRNA) 序列来构建基因编辑载体。进行农杆菌介导的转化，并使用分子生物技术方法分析了试验性的 E 0 AGL 编辑株系。与自交系“CT001”相比，两个 AGL19 编辑系（AGL19 基因靶序列中存在核苷酸序列突变）和四个 AGL24 编辑系（AGL24 基因靶序列中存在核苷酸序列突变）表现出特别晚的抽薹。使用芽授粉的世代进展获得了无 T-DNA 的 E 1 AGL 编辑系，其也表现出晚抽薹。AGL 蛋白功能的丧失是由于 AGL19 和 AGL24 基因中发生了插入/缺失突变，从而导致提前终止密码子。此外，移码突变导致结构变化并在 AGL19 和 AGL24 蛋白中引入提前终止密码子。我们的结果表明，CRISPR/Cas9 介导的 AGAMOUS 类基因编辑会导致晚熟表型，并且 CRISPR/Cas9 是一种用于分析大白菜 (Brassica rapa ssp. pekinensis) 基因功能的有用技术。
转运蛋白而非药物靶标的差异是刚果锥虫和锥虫亚属锥虫对二脒和三聚氰胺苯砷剂具有不同先天敏感性的主要决定因素
摘要：动物锥虫病是感染各种非洲锥虫种类的动物的疾病，例如布氏锥虫、伊氏锥虫、刚果锥虫、马背锥虫和间日锥虫。症状因宿主和感染物种以及感染阶段而异，可使用数十年前的少量锥虫杀虫剂进行治疗。一个复杂的问题是，并非所有锥虫物种对所有药物都同样敏感，而原因至多只是部分了解。在这里，我们研究药物转运蛋白（主要在布氏锥虫中发现）是否决定了不同的药物敏感性。我们报告称，氨基嘌呤转运蛋白 TbAT1 和水通道蛋白 TbAQP2 的同源物在刚果锥虫中不存在，而它们的引入使该物种对二脒（喷他脒、二脒氮）和三聚氰胺苯（美拉索明）类药物非常敏感。这些药物在转基因株系中的积累速度要快得多。刚果锥虫对苏拉明的敏感性本质上也低于布氏锥虫，尽管它对苏拉明的积累速度更快。在刚果锥虫中表达位于布氏锥虫溶酶体中的一种拟议的苏拉明转运蛋白并没有改变其对苏拉明的敏感性。我们得出结论，对于几类最重要的锥虫药而言，特定转运蛋白的存在，而不是药物靶标，才是药物疗效的决定性因素。
使用马铃薯 X 病毒载体中的非间隔 sgRNA 阵列工程进行高效的 Cas9 多重编辑
基于成簇、规则间隔、短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的系统彻底改变了许多生物体（包括植物）的基因组编辑。植物中的大多数 CRISPR-Cas 策略依赖于使用农杆菌进行遗传转化来提供基因编辑试剂，例如 Cas 核酸酶或合成向导 RNA (sgRNA)。虽然 Cas 核酸酶是编辑方法中的恒定元素，但 sgRNA 是靶向特异性的，通常需要筛选过程来识别最有效的 sgRNA。植物病毒衍生载体是将 sgRNA 快速有效地递送到成年植物中的一种替代方法，因为病毒具有基因组扩增和系统运动的能力，这种策略称为病毒诱导的基因组编辑。我们对马铃薯病毒 X (PVX) 进行了改造，以构建一种可在成年茄科植物中轻松表达多个 sgRNA 的载体。使用基于 PVX 的载体，本氏烟基因被有效靶向，在组成性表达化脓性链球菌 Cas9 的转化株系中产生近 80% 的插入/缺失。有趣的是，结果表明 PVX 载体允许表达不间隔 sgRNA 阵列，在成年植物组织中几天内实现高效的多重编辑。此外，可以从受感染组织或受感染植物种子再生的植物中获得无病毒编辑的后代，这些后代表现出高遗传双等位基因突变率。总之，这种新的 PVX 载体可以轻松、快速和高效地表达 sgRNA 阵列以进行多重 CRISPR-Cas 基因组编辑，并将成为跨不同植物物种（尤其是茄科作物）进行功能基因分析和精准育种的有用工具。
通过编辑非编码区域提高两种常规栽培水稻品种的白叶枯病抗性
摘要：xa13是一个隐性多效基因，对水稻抗病性起正向调控作用，对水稻育性起负向调控作用，严重制约了其在水稻育性中的应用。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术删除Xa13基因启动子部分序列，包括病原菌诱导表达元件，使编辑后的启动子区水稻失去病原菌诱导基因表达能力，但不影响叶片和花药中背景基因的表达，从而获得抗病性和正常产量。研究还筛选出一株删除目的序列、分离T 1 代（无转基因株系）外源转基因片段的抗病、育性正常植株家系，并对T 2 代水稻的重要农艺性状进行了研究。结果表明，添加/不添加外源DNA的T 2 代水稻在抽穗期、株高、单株穗数、穗长和田间结实率等方面与野生型均无统计学差异。成功转化2个重要常规水稻品种空育131（KY131，耿/粳稻）和黄华占（HHZ，鲜/籼稻），并获得抗病、丰产材料，是目前我国2个经过改良后可直接用于生产的重要常规水稻品种。转基因水稻（KY-PD和HHZ-PD）叶片中Xa13基因在病原菌侵染后没有被诱导表达，表明此方法可普遍有效应用，有利于推动xa13这一隐性抗病多效基因在水稻抗白叶枯病方面的实际应用。通过编辑基因非编码区调控基因表达的研究，为今后开展分子设计育种提供了新思路。
干细胞研究
转基因株系采用第二代 CRISPRa 系统，该系统携带与异源三聚体 VPR 反式激活因子融合的核酸酶缺陷型 dCas9，该异源三聚体 VPR 反式激活因子由 VP64、p65 和 RTA 结构域组成。该系统可用于解释任何所需细胞类型的内源性调控机制。使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法，我们以 AAVS1 人类基因组位点为目标，分别引入先前描述的 dCas9VPR-tdTomato（Schoger 等人，2020 年）和嘌呤霉素盒，这些盒受 CAG 和 EF1a 启动子的控制（图 1 A）。采用优化的核转染方案转染 LhiPSC-GR1.1 细胞。转染后，选择具有 tdTomato 表达的细胞并通过 PCR 进行基因分型（图 1B，引物结合如图 1A 所示，黑色引物仅扩增野生型 (WT) 片段；绿色引物扩增插入的构建体）。随后，扩增、分析和冷冻保存两个阳性克隆（#2 和 #3）。DNA 测序数据证实了 AAVS1 基因座中的正确和纯合敲入转基因整合（图 1C，显示为克隆#2）。PCR 结果显示，在筛选的 15 个克隆中，11 个克隆含有纯合插入（命名为 CRISPRa 细胞），1 个克隆是杂合的，3 个克隆不含有插入而是含有 WT 完整基因座（用作对照细胞）（数据未显示）。通过分析 PCR 和测序预测的前五个脱靶位点进行脱靶分析；在这些位点中均未发现任何编辑事件。对照电穿孔和非电穿孔 (参考) 系用于比较 (补充图 1A)。所有系的支原体检测均为阴性。通过基于 SNP 的核型分析和标准 G 带证明了 CRISPRa 克隆 #2 和 #3 以及对照细胞的基因组完整性。未检测到数值或结构异常的证据 (图 1D)。与核转染 (图 1Ei) 和非核转染对照相比，细胞生长和形态正常。与对照 hiPSC 相比，CRISPRa 中的 dCas9 和 tdTomato 表达证实了转基因表达，如 Western blot (补充图 1B，显示克隆 #2 和 #3) 和共聚焦显微镜 (图 1Eii，显示克隆 #2，n = 3 个不同传代) 所示。通过免疫荧光分析干性标记 OCT4 的表达（图 1 Eiii）和流式细胞术分析（显示 94.2% OCT4 和 99.9% TRA1-60 阳性细胞（图 1 Eiv）（显示克隆 #2））来评估多能性。通过在 CRISPRa 和对照系中形成胚状体 (EB) 和定向分化来测试向所有三个胚层的自发分化能力。免疫荧光分析证实了 AFP、β-III-Tu bulin 和 α-平滑肌肌动蛋白 (ACTA2) 的表达，进一步支持内胚层、外胚层和中胚层的命运（图 1 F，显示克隆 #2 和 #3）。转录水平分析表明配对盒 3 ( PAX3 ) 和微管相关蛋白 2 ( MAP2 ) 的表达表明外胚层分化；T-box 转录因子 T ( TBXT ) 表明中胚层命运，而 α-Feto-Protein ( AFP ) 表明内胚层分化（补充图 1 C，显示克隆 #2 和 #3）。我们研究了 CRISPRa 系用于研究通过定向 2D 分化产生的心肌细胞的适用性，这种分化产生了自发跳动的细胞（视频作为补充材料提供），具有强大的 α-辅肌动蛋白 2 (ACTN2) 和心脏肌钙蛋白 T (TNNT2) 心脏标志物表达（（补充图 1D，显示为克隆#2）。最后，我们通过确定与心脏肥大和代谢稳态有关的 KLF15 表达的诱导来测试 CRISPRa 系的功能。我们发现，与转染了非靶向 gRNA 的各自亲本系相比，设计用于结合 KLF15 转录起始位点 (TSS) 的 44 bp 5'-上游序列的单个指导 RNA 能够显着增强 CRISPRa 系（克隆#2 和#3）中 KLF15 的转录。对照细胞没有显示独立于转染的 gRNA 的活化（图 1G）。总之，使用完全表征的 hiPSC 系，我们生成了具有纯合靶向插入、正常核型和多能性的人类 CRISPRa 系，并显示出其激活