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预组装 Cas9 核糖核蛋白介导的基因缺失鉴定了灰盖菇中的碳分解代谢阻遏物及其靶基因
摘要 Cre1 是一种重要的转录因子，可调节碳分解代谢抑制 (CCR)，在真菌中广泛保守。cre1 基因已在几种子囊菌中得到广泛研究，而其在担子菌物种中基因表达调控的作用仍不太清楚。在这里，我们鉴定了 Coprinopsis cinerea 并研究了 cre1 的作用，Coprinopsis cinerea 是一种可以有效降解木质纤维素植物废物的担子菌模型蘑菇。我们使用一种基于 PCR 扩增的分裂标记 DNA 盒以及体外组装的 Cas9 引导 RNA 核糖核蛋白 (Cas9 RNPs) 的快速有效的基因缺失方法来生成 C. cinerea cre1 基因缺失菌株。两个独立的 C. cinerea cre1 突变体的基因表达谱显示碳水化合物代谢、植物细胞壁降解酶 (PCWDE)、质膜转运蛋白相关基因和几种转录因子编码基因等显著失调。我们的研究结果支持以下观点：与子囊菌中的报告一样，C. cinerea 的 Cre1 通过多种基因的联合调节来协调 CCR，包括 PCWDE、正向调节 PCWDE 的转录因子和可以导入可诱导 PWCDE 表达的单糖的膜转运蛋白。有些矛盾的是，虽然与其他伞菌一致，但与木质素降解相关的基因在 cre1 突变体中大多下调，表明它们受到的调节与其他 PCWDE 不同。基因缺失方法和此处提供的数据将扩展我们对担子菌中 CCR 的了解，并为与植物生物质降解相关的基因提供功能假设。
基于吸附性二氧化硅纳米结构的体内递送增强治疗性核糖核蛋白的基因编辑和碱基编辑
基因组编辑工具广泛安全应用的关键是将核糖核蛋白 (RNP) 的多种成分安全有效地递送到单细胞中，但这仍是其临床应用的生物障碍。为了解决这个问题，设计了一种基于生物相容性海绵状二氧化硅纳米结构 (SN) 的强大 RNP 递送平台，用于储存和直接递送治疗性 RNP，包括 Cas9 核酸酶 RNP (Cas9-RNP) 和碱基编辑器 RNP (BE-RNP)。与基于脂质的方法等商业化材料相比，通过靶向各种细胞和基因，可获得高达 50 倍的基因删除和 10 倍的碱基替换效率，且脱靶效率低。特别是，通过体内实体瘤模型中的静脉注射和小鼠眼中视网膜下注射的基于 SN 的递送成功诱导基因校正。此外，由于其毒性低、生物降解性高，SN 对器官细胞功能的影响微乎其微。由于工程化的 SN 可以克服与治疗性 RNP 应用相关的实际挑战，因此人们强烈期望该平台能够成为模块化 RNP 递送系统，从而促进体内基因删除和编辑。
核糖体 DNA 不稳定性是核型进化的潜在原因
核型是指基因组构成一组染色体的结构。物种间的核型差异预计会阻碍各种生物过程，如染色体分离和减数分裂染色体配对，从而可能导致不相容性。核型可以在近缘物种之间甚至同一物种的不同种群之间迅速变化。然而，人们对驱动核型进化的力量了解甚少。在这里，我们描述了从塞舌尔群岛分离出来的果蝇品系的独特核型。该品系丢失了 X 染色体上的核糖体 DNA (rDNA) 位点。由于 Y 染色体是唯一其他携带 rDNA 的染色体，所以所有雌性都携带至少一条 Y 染色体作为 rDNA 的来源。有趣的是，我们发现该品系还携带一条截短的 Y 染色体 (YS )，尽管它无法支持男性生育能力，但它在种群中稳定维持。我们的建模和细胞学分析表明，Y 染色体对雌性适应度的负面影响大于 YS 染色体。此外，我们生成了一个独立的菌株，该菌株缺乏 X rDNA，其核型为 XXY 雌性和 XY 雄性。该菌株迅速进化出多种核型：两个新的截短 Y 染色体（类似于 YS ），以及两个独立的 X 染色体融合，其中包含 Y 衍生的 rDNA 片段，从而消除了雌性对 Y 染色体的依赖。考虑到罗伯逊融合经常发生在人类的 rDNA 基因座上，我们提出 rDNA 基因座不稳定性可能是核型进化的驱动力之一。
利用 CRISPR-Cas9 和体外组装的核糖核蛋白操纵全局调节器 mcrA 上调温曲霉中的次级代谢产物
摘要：丝状真菌基因组测序表明，大多数次级代谢物生物合成基因簇 (BGC) 在标准实验室条件下处于沉默状态。在这项研究中，我们在温氏曲霉中建立了一个体外 CRISPR-Cas9 系统。为了激活原本沉默的 BGC，我们删除了负转录调节因子 mcrA 。当菌株在马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 上培养时，mcrA (mcrA Δ) 的缺失导致总共产生 17 种 SM。在 15 种 SM 中，有 9 种已得到充分表征，包括大黄素 ( 1 )、大黄酸乙酯 ( 2 )、sulochrin ( 3 )、大黄酸乙酯二蒽酮 ( 4 )、14- O-脱甲基sulochrin ( 5 )、( 反式 / 顺式 )-大黄素二蒽酮 ( 6 和 7 ) 和 ( 反式 / 顺式 )-大黄素大黄酸乙酯二蒽酮 ( 8 和 9 )。经发现，这些化合物均由相同的聚酮合酶 (PKS) BGC 产生。随后，我们在 mcrA Δ 背景下针对该 PKS 簇进行了二次敲除。双敲除菌株的代谢物谱揭示了先前未在 mcrA Δ 亲本菌株中检测到的新代谢物。从双敲除菌株中纯化出另外两种 SM，并被鉴定为曲霉酸 B ( 16 ) 和一种结构相关但之前未鉴定的化合物 ( 17 )。这项工作首次提出了一种能够在 A.wentii 中进行靶向基因编辑的简便遗传系统。这项工作还说明了进行双敲除以消除主要代谢产物的实用性，从而能够发现更多的 SM。■ 简介
新颖的核糖开关通过口服小分子诱导剂调节哺乳动物中的AAV传递的转基因表达
HEK 293细胞用荧光素酶构建体，其中含有鸟嘌呤适体的核糖开关（左），腺嘌呤适体（中间）或TPP Aptamers（右）。转染的细胞用适体配体以指定的剂量处理。图显示了开关对不同适体粘合剂的剂量反应。con 1是没有核糖开关盒的控制构建体。
CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物在急性髓系细胞基因组编辑中提高转染细胞的活力
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统已成为修改多种细胞类型基因表达的重要工具，在肿瘤治疗中显示出前所未有的潜力 (2)。许多研究已将 CRISPR/Cas9 应用于治疗相关的体外和体内实验 (3)。然而，由于 Cas9 蛋白的尺寸较大 (160 kDa)，CRISPR/Cas9 的应用受到限制。迫切需要高效、安全地将 CRISPR/Cas9 递送到 AML 细胞中以探索新的治疗靶点。近年来，CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物已通过电穿孔直接递送到肿瘤细胞中，由于 RNP 复合物的寿命短，脱靶效应减少 (4-9)。
用于 CRISPR 应用的 gRNA 和核糖核蛋白的表征
‒ 例如，(0.99) 99 = 37% 粗产量 ‒ 杂质更多，色谱分离更困难 ‒ pegRNA（基于 Cas9 sgRNA 进行主要编辑）甚至更长（~140 聚体）
使用预组装的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物在禾谷镰刀菌中进行基因组编辑
使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统进行基因组编辑极大地促进了真菌病原体的遗传分析。穗枯萎病真菌禾谷镰刀菌会给具有重要经济价值的谷类作物造成毁灭性损失。最近开发用于禾谷镰刀菌的 CRISPR-Cas9 系统使得基因组编辑更加高效。在本研究中，我们描述了一种基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑工具，用于将预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 直接递送到禾谷镰刀菌的原生质体中。使用 RNP 显著增加了转化子的数量和成功用选择标记替换目标基因的转化子的百分比。我们表明，由 Cas9 核糖核蛋白介导的单个双链 DNA 断裂足以实现基因删除。此外，短同源重组仅需要靶基因两侧 50 个碱基对区域。Cas9 RNPs 的高效率使得大规模功能分析、必需基因的鉴定和基因删除成为可能，而这些是传统方法难以实现的。我们期望我们的方法将加速禾谷镰刀菌的遗传学研究。
首次通过核糖核蛋白（RNP ...
摘要：Castanea sativa是全球重要的树坚果物种，以其多功能作用，尤其是木材和坚果生产而受到高度赞赏。如今，需要采取新的策略来实现对疾病，气候变化，更高产量和营养质量的植物弹性。 在新的植物育种技术（NPBT）中，CRISPR/CAS9系统代表了在短时间内改善植物育种的强大工具。 此外，CRISPR/CAS9构建体可以以核糖核蛋白（RNP）的形式传递到细胞中，从而避免通过原生质体技术避免外源DNA（无GMO-FRO）整合，这代表了基因编辑的有趣材料，这要归功于高度渗透性的DNA膜。 在本研究中，我们开发了从欧洲栗子体细胞胚胎开始的第一个原生质体隔离方案。 针对细胞壁消化优化的酶溶液含有1％纤维素酶Onozuka R-10和0.5％MacRozyme R-10。 在黑暗条件下在25℃孵育4小时后，获得了4,500,000个原生质体/mL的产率（可行的91％）。 使用GFP标记基因评估转染能力，转染原生质体的百分比为51％，在转染事件后72小时。 然后对靶向植物去饱和酶基因的直接递送进行了纯化的RNP。 结果揭示了CRISPR/CAS9 RNP和有效的原生质体编辑的预期目标修饰。如今，需要采取新的策略来实现对疾病，气候变化，更高产量和营养质量的植物弹性。在新的植物育种技术（NPBT）中，CRISPR/CAS9系统代表了在短时间内改善植物育种的强大工具。此外，CRISPR/CAS9构建体可以以核糖核蛋白（RNP）的形式传递到细胞中，从而避免通过原生质体技术避免外源DNA（无GMO-FRO）整合，这代表了基因编辑的有趣材料，这要归功于高度渗透性的DNA膜。在本研究中，我们开发了从欧洲栗子体细胞胚胎开始的第一个原生质体隔离方案。针对细胞壁消化优化的酶溶液含有1％纤维素酶Onozuka R-10和0.5％MacRozyme R-10。在黑暗条件下在25℃孵育4小时后，获得了4,500,000个原生质体/mL的产率（可行的91％）。使用GFP标记基因评估转染能力，转染原生质体的百分比为51％，在转染事件后72小时。然后对靶向植物去饱和酶基因的直接递送进行了纯化的RNP。结果揭示了CRISPR/CAS9 RNP和有效的原生质体编辑的预期目标修饰。
用于基因组编辑的 Cas9 核糖核蛋白的制备
通过递送预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 RNP) 进行基因组编辑是一种越来越流行的方法，适用于难以通过传统质粒和病毒方法进行遗传操作的细胞类型。Cas9 RNP 编辑稳健、精确、能够多路复用且不含遗传物质。它在细胞中的短暂存在限制了残留的编辑活性。该方案描述了通过异源表达和从大肠杆菌纯化来制备重组化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白，以及通过体外转录和 PAGE 纯化合成 CRISPR 向导 RNA。SpCas9 是第一个发现的 CRISPR Cas9（Jinek 等人，2012 年），也是基因组编辑应用中最典型的 Cas 酶之一。使用这种 Cas9 RNP 配方，我们已证明通过电穿孔在原代人类 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞中以及通过聚乙二醇介导的转化在真菌和植物中实现了高效的基因组编辑。我们的 Cas9 RNP 制备协议是一致且简单的，可用于其他细胞类型和生物体的基因组编辑。