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用于基因组编辑的 Cas9 核糖核蛋白的制备
通过递送预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 RNP) 进行基因组编辑是一种越来越流行的方法，适用于难以通过传统质粒和病毒方法进行遗传操作的细胞类型。Cas9 RNP 编辑稳健、精确、能够多路复用且不含遗传物质。它在细胞中的短暂存在限制了残留的编辑活性。该方案描述了通过异源表达和从大肠杆菌纯化来制备重组化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白，以及通过体外转录和 PAGE 纯化合成 CRISPR 向导 RNA。SpCas9 是第一个发现的 CRISPR Cas9（Jinek 等人，2012 年），也是基因组编辑应用中最典型的 Cas 酶之一。使用这种 Cas9 RNP 配方，我们已证明通过电穿孔在原代人类 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞中以及通过聚乙二醇介导的转化在真菌和植物中实现了高效的基因组编辑。我们的 Cas9 RNP 制备协议是一致且简单的，可用于其他细胞类型和生物体的基因组编辑。
Alt-R CRISPR-CAS9系统： - 核糖核蛋白的输送...
*我们保证，使用Alt-R-R Crispr-Cas9指南RNA（CRRNA：TRACRRNA DUPLEX或SGRNA）和Alt-R S.P.cas9核酸酶或Alt-R S.P.HIFI Cas9核酸酶。 编辑分析必须在DNA水平上，例如使用Alt-R基因组编辑检测试剂盒或DNA测序。 如果未在成功的指导RNA中观察到成功的编辑，而在适当的阳性控制成功的同时，将批准对先前设计的ALT-R CRISPR-CAS9指南RNA进行一次“无成本”替换。 此保证不会扩展到任何替代产品，或任何其他发生或附带费用或费用。HIFI Cas9核酸酶。编辑分析必须在DNA水平上，例如使用Alt-R基因组编辑检测试剂盒或DNA测序。如果未在成功的指导RNA中观察到成功的编辑，而在适当的阳性控制成功的同时，将批准对先前设计的ALT-R CRISPR-CAS9指南RNA进行一次“无成本”替换。此保证不会扩展到任何替代产品，或任何其他发生或附带费用或费用。
使用 dpy-10 Co-CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。
使用 dpy-10 Co-CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。
方案优化 CRISPR-Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物的电穿孔，用于人类多能干细胞中的无选择同源重组
d. 将培养板放入 37 C 培养箱中并孵育 10 分钟。每 3-4 分钟轻轻摇晃培养板一次有助于完全分离细胞。 e. 加入 1 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，并轻轻吹打细胞直至 iPSC 完全分离。 f. 计数细胞，并将 1.0 3 10 4 –1.5 3 10 4 个细胞接种到 iMatrix 涂层的 6 孔板中，该板含有 2 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，如步骤 cg 中所述，将细胞在 37 C 的 CO 2 培养箱中孵育过夜。 h. 第二天，用 2 mL StemFit 培养基更换培养基。如果有很多死细胞漂浮，继续向培养基中添加 Y-27632，最终浓度为 10 m M。 i.培养期间每 2 天更换一次培养基。j. iPSC 在第 6-8 天将达到半汇合状态。切勿让它们过度汇合。“半汇合”是指 iPSC 菌落直径小于 2 毫米，并且 iPSC 菌落之间仍有一些间隙。生长速度取决于 iPSC 系，因此应通过实验确定半汇合时间。
高纯度生产和DNA碱基编辑核糖核蛋白的精确编辑
核糖核蛋白（RNP）复合物介导的碱基编辑预计将非常有益，因为与质粒或病毒载体介导的基因编辑相比，其具有脱靶效应，尤其是在治疗应用中。但是，在细菌系统中产生丰富的产量和高纯度的重组胞嘧啶基础编辑器（CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（ABES）的生产具有挑战性。在这里，我们从人类细胞表达系统中获得了高度纯化的CBE/ABE蛋白，并且表明CBE/ABE RNP表现出不同的编辑模式（即，与质粒编码的CBE/ABE相比，CBE/ABE的转化率较小（即，多个碱基与单个碱基的转化率较小），主要是导致细胞中RNP的寿命有限的原因。此外，我们发现与质粒编码的ABE相比，ABE RNP的DNA和RNA的脱靶效应大大降低。我们最终将NG PAM – tarbetable -abe RNP应用于视网膜变性12（RD12）模型小鼠中的体内基因校正。
利用冲击波介导的核糖核蛋白递送对烟草 ADF 基因进行定向诱变，提高渗透胁迫耐受性
建立了工作流程后，我们随后使用脉冲激光诱导冲击波法将 RNP 直接递送到完整的烟草叶片细胞中，这比原生质体或受精卵更容易制备和处理。我们引入了一个预组装的 RNP，它包含 HiFi Cas9 蛋白、crispr RNA (crRNA) 和 ATTO-550 标记的反式激活 crispr RNA (tracrRNA)，靶向烟草 PDS 或 ADF 基因。荧光 tracrRNA 允许直接筛选转染细胞，因此不需要选择标记基因（图 2A'）。样本大小和实验设置与上面描述的 DsRed 转染相同（图 1A、B）。根据我们的观察，ATTO-550 荧光在激光处理后 24 小时开始变得可见，在转染后 48 小时达到最大值。根据制造商的说法，RNP 复合物的活性最长为 72 小时。
降低 α-突触核蛋白作为治疗策略......
通缉！ 名称 α-突触核蛋白，别名：NACP、PARK1/PARK4 地址 染色体 4q22.1 身高/体重 140 个氨基酸，14 kDa 蛋白质 外观 单体，四聚体 α -螺旋寡聚体，与生物膜相关 犯罪聚集体可导致帕金森氏症
RBM20 获得功能性心肌病突变重新连接剪接调控并重新分配处理体内的核糖核蛋白颗粒
心脏剪接因子 RBM20 的突变会导致恶性扩张型心肌病 (DCM)。为了了解 RBM20 相关 DCM 的机制，我们设计了具有 DCM 相关 RBM20 错义突变的同源 iPSC 以及 RBM20 敲除 (KO) iPSC。由这些细胞系制成的 iPSC 衍生的工程心脏组织重现了 RBM20 相关 DCM 的收缩功能障碍，并且显示错义突变的功能障碍比 KO 更严重。通过 eCLIP 对 RBM20 RNA 结合的分析表明，突变型 RBM20 对与肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和加工体相关 RNA 结合蛋白 (FUS、DDX6) 共享的 3′UTR 序列具有功能获得偏好。深度 RNA 测序表明，RBM20 R636S 突变体具有独特的基因、剪接、多聚腺苷酸化和环状 RNA 缺陷，与 RBM20 KO 不同。超分辨率显微镜验证了突变体 RBM20 保持非常有限的核定位潜力；相反，突变蛋白在基础条件下与细胞质加工体 (DDX6) 结合，在急性应激后与应激颗粒 (G3BP1) 结合。总之，我们的结果强调了通过剪接依赖和非剪接途径导致心脏疾病的致病机制。
单氟化促进了α-突触核蛋白的分泌错误折叠相关的分泌。
包括在研究人群中；指数日期的平均年龄为58.8岁，男性为60.0％。从第一个观察的MM诊断到指数日期的时间平均为47.5个月。在索引日期的平均随访时间为20.9个月期间，有64.7％的患者（n = 55）启动了第二批批次，35.2％（n = 30）至少收到3个批次。在随访期间，平均每位患者全因医疗保健费用为722,992美元（相当于每位患者每月34,578美元[PPPM]）。总数约为90.7％（每位患者655,524美元），因为医疗保健费用与MM相关，其中66.0％是MM药物/输注成本。结论：在这项现实世界中的研究中，TCE患有高医疗保健成本的MM患者，大多数是MM相关的，主要归因于MM药物和输注成本。
