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CRISPR/CAS9核糖核蛋白介导的HTERT-RPE1细胞中的敲除蛋白
图1。使用ssDNA或PCR产物作为HDR模板（a）上部的蛋白质标记的策略示例：据报道编码Centriolar远端附属物蛋白SCLT1的C-末端的基因组序列。带下划线的序列代表CrRNA识别位点，PAM序列为黄色，垂直虚线表示切割位点。鉴于距离内源性终止密码子（BOLD大写字母的TAA）距离为14 bp，插入位点被任意定位为距剪切位点1 bp的位置，即在SCLT1的密码子之间的最接近的交界处。在下部，密码子（上图）和相应的氨基酸性残基（下图）构成了插入物：蓝色大写字母是指可易加的链接器，然后是v5-tag（红色）和附加的外源终止密码子（黑色）。50 bp lha或rha = 50碱基对左同源臂或右同源臂。（b）使用PCR产物作为供体DNA生成具有荧光蛋白（FP）的蛋白质（您最喜欢的蛋白质，YFP）的C端标记的示意图。PCR模板由带有FP，2A元件和电阻盒（R）的标准质粒（左侧）组成。使用一对60mer引物进行PCR反应。在右侧代表了目标基因座（您最喜欢的基因，YFG）的编辑。
CRISPR 核糖核蛋白介导的植物基因工程
CRISPR 衍生的生物技术彻底改变了基因工程领域，并已广泛应用于基础植物研究和作物改良。常用的农杆菌或粒子轰击介导的转化方法用于传递质粒编码的 CRISPR 试剂，可导致外源重组 DNA 的整合和潜在的脱靶诱变。编辑效率也高度依赖于表达盒及其基因组插入位点的设计。使用 CRISPR 核糖核蛋白 (RNP) 进行基因工程已成为一种有吸引力的方法，具有许多优势：无 DNA/转基因编辑、最小的脱靶效应、由于 RNP 快速降解而降低毒性以及能够在保持高编辑效率的同时滴定其剂量。尽管 RNP 介导的基因工程已在许多植物物种中得到证实，但其编辑效率仍然不高，并且由于植物再生和选择的困难，其在许多物种中的应用受到限制。在这篇综述中，我们总结了 RNP 介导的植物基因工程的当前发展和挑战，并提供了未来的研究方向，以扩大该技术的使用。
通过预复合的 CRISPR-Cas9/sgRNA 核糖核蛋白避开细胞抑制 RNA，实现高效的 ssODN 介导靶向
结合 CRISPR-Cas9 技术和单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)，可以在诱导性多能干细胞 (iPSC) 中的目标基因组位点引入特定的单核苷酸改变；然而，与缺失诱导相比，ssODN 敲入频率较低。尽管已报道了几种 Cas9 转导方法，但是 CRISPR-Cas9 核酸酶在哺乳动物细胞中的生化行为仍有待探索。在这里，我们研究了影响 Cas9 体外裂解活性的内在细胞因素。我们发现细胞内 RNA（而不是 DNA 或蛋白质部分）会抑制 Cas9 与单向导 RNA (sgRNA) 结合并降低酶活性。为了防止这种情况，与 Cas9 过表达方法相比，在递送到细胞之前预复合 Cas9 和 sgRNA 可产生更高的基因组编辑活性。通过优化预复合核糖核蛋白和ssODN的电穿孔参数，我们实现了高达70%的单核苷酸校正效率和高达40%的loxP插入效率。最后，我们可以用C2等位基因替换HLA-C1等位基因，以生成组织相容性白细胞抗原定制编辑的iPSC。
ReMOT 控制递送 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物以诱导疾病媒介蚊子淡色库蚊的种系诱变
淡色库蚊复合体分布广泛，导致蚊媒疾病在人类中的传播难以预防。使用 CRISPR/Cas9 基因编辑是一种有效的技术，有可能解决日益严重的蚊媒疾病问题。本研究利用 ReMOT 控制技术在淡色库蚊中生产转基因蚊子。通过注射 60 只成年雌蚊建立了显微注射系统——需 14 µ l 注射混合物，使用≤1 µ l 的内体释放试剂（氯喹或皂苷）不会发生沉淀。在采血后 24 小时（卵黄发生高峰期）注射 P2C 增强型绿色荧光蛋白-Cas9（P2C-EGFP-Cas9）核糖核蛋白复合物进入卵巢的效率为 100%。利用此方法进行KMO敲除，我们发现当通过ReMOT Control将P2C-Cas9 RNP复合物注射到淡色库蚊成年血淋巴中时，卵巢中也能发生基因编辑。在氯喹组，筛选出的2,251只G 0 子代中，9只个体表现出白眼和马赛克眼表型。在皂苷组，筛选出的2,462只G 0 子代中，观察到8只突变个体。测序结果显示13 bp的缺失，进一步证实了发生基因编辑的事实。总之，ReMOT Control在淡色库蚊中的成功应用，不仅为该方法提供了基本参数（注射参数和注射时间），而且有利于蚊虫生物学和防治的研究。
使用CRISPR-CAS9核糖核蛋白复合物
白内障是全球失明的主要原因。先天性或小儿白内障也可能导致永久性视力障碍或失明，即使尝试进行最佳尝试。很大一部分小儿白内障具有遗传原因。因此，识别导致白内障形成的基因对于理解遗传性小儿白内障的病理过程以及新疗法的发展至关重要。尽管基因组技术取得了明显进展，但对新鉴定的候选基因和变体的生物学效应的验证仍然具有挑战性。在这里，我们提供了一条逐步的管道，使用CRISPR-CAS9核糖核蛋白复合物（RNP）评估F0斑马鱼中的白内障候选基因。包括CRISPR-CAS9 RNP设计和配方的详细片段，微注射，CRISPR-CAS9 RNP RNP剂量和交付途径的优化，编辑功效分析以及白内障形成评估。遵循此协议，可以在2周内使用基本实验室供应在2周内轻松评估任何白内障候选者。
基于支架的 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白递送……
Chooi, W. H.、Chin, J. S. 和 Chew, S. Y. (2021)。基于支架的 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白递送用于基因组编辑。分子生物学方法，2211，183-191。doi:10.1007/978-1-0716-0943-9_13
通过基于核糖核蛋白的CRISPR – CASPR – CAS9系统从可再生生物量生产的琥珀酸生产的曲果蛋白CRISPR – CAS9系统 niger的代谢工程 通过在纳米镜上进行多聚体的适体来改善癌症靶向 脊柱操纵对运动单位行为的影响 集成能量系统的协调操作WP1 Aalborg Univertet技术数据和天然气成本... 使用低成本的开源脑部计算机界面和3D打印的手腕外骨骼诱导神经可塑性
摘要背景：琥珀酸具有巨大的潜力，可以成为基于生物的新基础，用于推导工业中多种增值化学品。基于可再生生物量的琥珀酸生产可以提供一种可行的方法来部分减轻全球制造对石油炼油厂的依赖性。为了改善生物过程的经济学，我们试图通过真菌细胞平台探索可能的解决方案。在这项研究中，尼日尔（Aspergillus Niger）是一种著名的生物基有机酸工业生产生物，因其琥珀酸产生的潜力而被利用。结果：使用核糖核蛋白（RNP）的CRISPR – CAS9系统，连续的遗传操作是在产生柠檬酸菌株的工程中实现的。两种涉及两种副产品的基因，即葡萄糖酸和草酸，被破坏。此外，有效的C 4-二羧酸盐转运蛋白和可溶性NADH依赖性富马酸酸盐还原酶被过表达。所得的菌株SAP-3产生了17 g/l琥珀酸，而使用合成底物在野生型菌株中未检测到可测量水平的琥珀酸。此外，还研究了两个培养参数，温度和pH值，以实现其对成功的粉刺产生的影响。3天后在35°C下获得最高量的琥珀酸，低培养pH值对琥珀酸的产生具有抑制作用。探索了两种类型的可再生生物量作为琥珀酸产生的底物。6天后，SAP-3菌株能够分别从甜菜糖蜜和小麦水解物中产生23 g/L和9 g/l琥珀酸。结论：在这项研究中，我们成功地将基于RNP的CRISPR-CAS9系统应用于尼日尔的基因工程中，并显着改善了工程菌株中的琥珀酸产生。关于栽培参数的研究揭示了pH和温度对琥珀酸产生的影响以及未来在菌株发展中的挑战。使用可再生生物量使用糖浆和小麦稻草水解产物来证明了可再生生物量来生产琥珀酸。关键字：尼日尔曲霉，代谢工程，琥珀酸生产，CRISPR – CAS9系统
通过将核糖核蛋白电穿孔到Zona-Intact牛胚胎
体细胞核转移或细胞质显微注射已用于产生基因组编辑的农场动物。但是，这些方法具有降低其效率的几个缺点。这项研究旨在开发电穿孔条件，使CRISPR/CAS9系统的传递到牛为有效的基因敲除。我们优化了电穿孔条件，以传递CAS9：SGRNA核糖核蛋白到牛合子，而不会损害胚胎发育。较高的电穿孔脉冲电压导致膜渗透性增加。但是，高于15 v/mm的电压降低了胚胎发育潜力。牛胚胎的Zona卵石不是有效的RNP电穿孔的障碍。使用针对最大膜通透性进行优化的参数，同时我们在靶向牛OCT4时达到了高基因编辑的速率，这导致100％评估的胚胎和预期在莫拉拉阶段对胚胎发育的预期停滞的100％蛋白质。总而言之，CAS9：SGRNA核糖核蛋白可以通过电穿孔到Zona-Intact牛合子的能力递送，从而导致有效的基因敲除。
CRISPR/Cas 与核糖核蛋白复合物和瞬时选择端粒载体可在灰葡萄孢菌中实现高效的无标记和多重基因组编辑
CRISPR/Cas 已成为多种生物体中遗传操作的最先进的技术，能够以前所未有的效率进行有针对性的遗传改变。本文中，我们报告了在重要的坏死性植物病原体灰霉病中首次建立强大的 CRISPR/Cas 编辑，该方法基于将优化的 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物 (RNP) 引入原生质体。通过开发一种将 RNP 递送与含端粒的瞬时稳定载体共转化相结合的新策略，进一步提高了编辑产量，从而允许临时选择和方便地筛选无标记编辑事件。我们证明，与现有的基于 CRISPR/Cas 的丝状真菌方法（包括模型植物病原体稻瘟病菌）相比，这种方法提供了更高的编辑率。编辑菌株的基因组测序显示很少有额外的突变，也没有 RNP 介导的脱靶证据。端粒载体介导编辑的高性能通过随机诱变 sdhB 基因的 272 个密码子得到证实，该基因是琥珀酸脱氢酶抑制剂 (SDHI) 杀菌剂抗性的主要决定因素，方法是将 272 个密码子批量替换为编码所有 20 种氨基酸的密码子。在没有选择的情况下，所有交换的频率都相似，但 SDHI 选择允许识别新的氨基酸替换，这些替换赋予了对不同 SDHI 杀菌剂的不同抗性水平。基于 RNP 的共转化效率提高且易于操作，有望加速 B . cinerea 和其他真菌的分子研究。
文章 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白介导的基因编辑后，人类视网膜色素上皮细胞和人类 Muller 细胞中 VEGF-A 的表达降低
以及世界各地。开发缓释制剂和装置以及更长效的药物是解决这些问题的一些方法。然而，还没有任何迹象表明这些方法中的任何一种可以带来永久性的治疗。基因疗法有可能永久降低 VEGF-A 水平并消除频繁玻璃体内注射的需要。基因增强和基因沉默方法都已用于降低 VEGF-A 水平。4 – 6 基因沉默尚未进入人体临床试验，但使用 microRNA 和 shRNA 的体外和体内研究已证明在降低 VEGF 方面取得了一些成功。7 – 9 近年来，成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 相关蛋白 9 (Cas9) 已用于破坏视网膜色素上皮 (RPE) 细胞和小鼠视网膜中的 VEGF-A 基因。 10 – 12 在视网膜中，VEGF 在 Muller 细胞、RPE 细胞、神经节细胞以及视网膜和脉络膜血管中持续表达；在病理性血管生成状态下，这种表达显著增加。13、14 我们研究的目的是评估 VEGF-A 基因破坏对 Muller 细胞和 RPE 细胞的影响，这两者都是眼睛中主要的 VEGF 产生者。我们使用了通过脂质体 CRISPRMAX (LCM) 递送的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。