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CRISPR 工具、技术开发和应用
基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑工具彻底改变了几乎所有生命科学领域，尤其是植物生物学（Hu 和 Li，2022 年）。该技术为基础研究增加了一个新维度，通过敲除或激活基因来研究基因的功能。CRISPR 系统的主要重要应用是开发植物的有针对性的基因改造，以更好地应对日益不利于提高植物生产力的变化的气候。事实证明，精确的基因组编辑比传统的诱变或转基因安全得多，特别是因为变化通常涉及单个核苷酸，并且不一定与修饰基因组中是否存在外来 DNA 有关（El-Mounadi 等人，2020 年；Jung 和 Till，2021 年）。尽管 CRISPR 工具的发展非常迅速且不断改进，但仍有许多挑战需要克服。在本研究主题中，我们尝试展示高效和精确编辑植物基因组的前景，并介绍其在解决植物生物学和粮食安全当前问题中的应用。目前，已经开发了许多工具来编辑目标基因座。不幸的是，通常可用的工具对某些植物物种效率低下，或倾向于在脱靶位点诱发非预期突变。实现高效基因组编辑的可能性也直接基于转化技术的发展和将必需的 CRISPR 系统组件递送到植物细胞，这通常比动物细胞复杂得多。就多种园艺作物而言，转基因育种已导致转基因植物的产生（Ghag 等人，2022 年），但一些蔬菜已成功实现基因组编辑。西兰花转基因植物的开发主要集中在营养品质和抗逆性上。世界上发生的重要疾病之一是根肿病，由根肿菌引起，影响油菜、花椰菜、西兰花、抱子甘蓝、大白菜和萝卜。因此，需要开发针对性地将抗性基因导入栽培品种的方案。赵等人建立了一种基于农杆菌属的有效转化系统，可用于
分裂的放大多态性序列（CAP）标记，用于鉴定Rapeseed Bnaa.fad2基因
摘要冬季油菜的两个突变体（甘蓝纳普斯L. var。oleifera）通过化学诱变（HOR3-M10453和HOR4-M10464）培养种子中含有含油酸的量。突变植物的整体性能远低于野生型品种。具有高收益的双低（“ 00”）品种和具有有价值的农艺性状的繁殖品种的多个回合，然后需要选择高油酸基因型，以获得新的“ 00”种类的新“ 00”品种，具有高油酸含量的种子中的高油酸含量。要执行此类选择，使用了特定的裂解扩增的多态性序列（CAPS）标记。该标记旨在检测去饱和酶基因BNAA.FAD2中两个相关点突变的存在，并且先前已对其进行了描述和专利。使用FSP BI限制酶消化了特定的聚合酶链反应产物（732 bp），该酶识别5'-C↓TAG -3'序列，这是两个突变等位基因共有的，从而对这些等位基因特异性产生带模式。重新设计了该专利中提出的方法，调整为特定的实验室条件并进行了彻底的测试。测试了不同的DNA提取方案以优化过程。CAPS方法的两个变体（带有和不使用放大产品的净化）被认为选择最佳选择。此外，还测试了研究标记检测BNAA.FAD2基因座中杂合性的能力。最后，我们还提供了一些在繁殖计划中使用标记辅助选择（MAS）中使用新帽标记的示例。建议使用CAPS标记的DNA提取的标准CTAB方法和简化的两步（放大/消化）程序。标记物被发现可用于检测研究的BNAA.FAD2去饱和酶基因的两个突变等位基因，并有可能确保育种者的霍尔线纯度。然而，还表明它无法检测到任何其他揭示的等位基因或基因在油酸水平的调节中起作用。
HyGenesis 系统：
测试的代表性微生物：（部分概要）HyGenesis 系统：细菌 醋酸钙不动杆菌 1 真菌 黑曲霉 基于独特的抗菌技术，可有效控制各种处理物品和基质上的细菌、真菌、藻类 枯草芽孢杆菌 烟曲霉 和酵母。抗菌活性物质是在美国环境保护局和全球类似监管机构注册的猪布鲁氏菌 杂色曲霉 布鲁氏菌 出芽短梗霉 伯克霍尔德菌 洋葱毛壳菌。这种抗菌剂已安全有效地使用了三十多年。产气荚膜梭菌 镰刀菌 鲍氏棒状杆菌 粉红粘帚菌 本表是应众多要求编制的，要求提供该技术有效的微生物清单。我们选择了大肠杆菌 ATCC 23266 白色青霉菌，以提供测试谱，其中大肠杆菌 1 黄青霉菌 代表所有重要类型和猪嗜血杆菌 柑橘青霉菌 微生物种类。流感嗜血杆菌 秀丽隐杆线虫 肺炎克雷伯菌 ATCC 4352 绳状青霉 干酪乳杆菌 腐殖质青霉 乳酸明串珠菌 青霉菌 单核细胞增多性李斯特菌 变异青霉 耐甲氧西林葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 黑根霉 微球菌 sp. Stachybotrys atra 耻垢分枝杆菌 黄木霉 结核分枝杆菌 趾间毛癣菌 痤疮丙酸杆菌 须毛癣菌 奇异变形杆菌 藻类 奇异变形杆菌1 鱼腥藻 B-1446-1C 普通变形杆菌 小球藻 铜绿假单胞菌 Gium sp. LB 9c 铜绿假单胞菌 PRD-10 波恩颤菌 LB143 铜绿假单胞菌 1 胸膜球菌属 LB11 洋葱假单胞菌 四尾假单胞菌 细长月牙藻 B-325 猪霍乱沙门氏菌 团藻属 LB 9 伤寒沙门氏菌 酵母菌 金黄色葡萄球菌（无色素）1 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌（有色素）1 酿酒酵母 表皮葡萄球菌 1 病毒 粪链球菌 禽流感 变形链球菌 HIV B 万古霉素耐药肠球菌 (VRE) 甲型流感 野油菜黄单胞菌 SARS
遗伝子组换え技术の最新动向
Plants Australian Genetic Recombination Regulation Organization (OGTR) accepts field testing of CSIRO's genetically modified canola The Australian Genetic Technology Regulation Organization (OGTR) has issued a licensed DIR 205 to the Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO) to allow field testing of genetically modified (GM) canola with increased tolerance of abiotic stress.通用汽油菜石可以在新南威尔士州和南澳大利亚州的最多三个地点生长，第一年最多可容纳1.5公顷，明年最多2公顷。考试将于2025年5月至2030年12月。该现场测试的目的是评估在澳大利亚野外条件下（包括环境压力）下GM菜籽菌株的性能。在此现场测试中生长的GM菜籽无用于人类食物或牲畜饲料。 最终的风险评估和风险管理计划（RARMP）得出的结论是，这种有限和受控的释放对人们以及环境的健康与安全的风险可忽略不计。但是，施加许可条件以限制释放的大小，位置和持续时间，并限制了转基因作物及其在环境中的遗传物质的扩散和保留。 最终的RARMP可在OGTR网站的DIR 205页面上在线获得，以及RARMP的摘要，有关此决定的问答以及许可证的副本。 Wageningen的研究人员和合作伙伴开发了对TR4的第一个香蕉，Wageningen大学研究所的黑人Sigatoka研究人员与Chiquita，Keygene和Musaradix合作，开发了一种新的混合香蕉黄道，该Yellebrid Banana黄道对两种最具破坏性的疾病抗体性疾病，是Bananas：Fusarium Tropical Race 4（tr4）和黑色SIGAKA（TR4）。黄道一号的发展是在世界各地的香蕉种植的重要时期的开创性事件。 近年来，TR4和Black Sigatoka造成了重大损失，造成了价值数亿美元的损失。黄道一号对TR4具有抗药性，TR4具有损坏整个农场的霉菌，而黑色Sigatoka是一种大大降低产量的叶片疾病。这两种疾病一直是对香蕉行业的长期威胁，特别是对广泛出口的卡文犬香蕉的威胁。 研究团队将传统交配技术与最新的DNA分析技术相结合，以加速黄道一个开发过程。这使得可以更迅速有效地选择具有理想性状（例如抗病性）的新品种。黄道一号仍然是原型，目前在荷兰的温室中生长。预计将被送往菲律宾和印尼地区，在那里TR4和Black Sigatoka造成严重破坏。
CRISPR/Cas9：功能多样、应用广泛的强大基因组编辑工具
自 2012 年首次发现一种潜在的基因组编辑工具以来 [1,2]，CRISPR/Cas9 系统已成为一种强大而稳健的基因组编辑工具，用于基因功能研究和作物改良。在过去十年中，随着新 Cas 酶的鉴定、现有 Cas9 酶的修饰以及新生物信息学工具的开发，基于 CRISPR/Cas9 的研究发展极为迅速。特别是 Cas 酶的修饰大大提升了 CRISPR/Cas9 基因组编辑的应用潜力 [3]。尽管在基因组编辑中还鉴定和利用了许多其他 Cas 酶，但 CRISPR/Cas9 系统目前指任何 CRISPR/Cas 系统，包括 Cas12 和 Cas13，主要是因为 Cas9 是基因组编辑中第一个也是最常用的 Cas 酶 [4]。目前，CRISPR/Cas9 基因组编辑已广泛应用于许多植物物种，包括模式植物物种和重要的农业作物，如小麦 [5]、棉花 [6] 和大豆 [7]，不仅用于基因功能研究，还用于作物改良。为了促进 CRISPR/Cas9 基因组编辑的快速开发和应用，我们编辑了这期“植物基因组编辑”特刊。在短时间内，这个特刊引起了科学界和工业界的广泛关注。最后，经过专家的同行评审，共有 15 篇论文被接受在 International Journal of Molecular Sciences 的这期特刊上发表。在发表的 15 篇论文中，有 3 篇是及时的综述论文。Jansing 等人（2019）回顾了农业中基因组编辑的技术和实践考虑，特别关注了 CRISPR/Cas9 系统进入植物细胞的当前递送方法及其再生方法。他们还讨论了 CRISPR/Cas9 对改良重要农业作物不同性状的适用性[8]。在所有作物中，利用 CRISPR/Cas 基因组编辑技术在水稻上取得了重大进展。在 Fiaz 等人 (2019) 撰写的一篇综述中，他们回顾了 CRISPR/Cas9 在水稻改良，特别是在稻米品质改良方面的现状[9]。提高 CRISPR/Cas9 的靶向效率、降低非靶向效应一直是基因组编辑的主要课题。在过去的五年里，许多效应被添加到这个领域。在这期特刊中，Hajiahmadi 等人 (2019) 回顾了降低 CRISPR/Cas9 非靶向效应的主要策略。他们认为，单向导RNA（sgRNA）与配体依赖性适体酶策略相结合可能是降低植物非靶标突变频率的有效策略[10]。其余12篇研究文章涉及12种不同的植物物种，包括水稻[11]、棉花[12]、小麦[13,14]、油菜[15]、大豆[16]、红薯[17]、豇豆[18]、番茄[19]、马铃薯[19]、菊苣[20]和模式植物拟南芥[21]，以及藻类莱茵衣藻[22]。从这里可以清楚地看到，越来越多的研究集中在农业上重要的作物上。这些研究中大多数都采用传统的CRISPR/Cas9技术来敲除单个基因，只有一项研究采用CRISPR/Cas9碱基编辑器创建了无转基因的基因组编辑番茄和马铃薯[19]。在这些研究中，大多数都致力于农业上重要的性状。例如，Wang等人（2019）通过CRISPR/Cas9基因组编辑研究了IbGBSSI和IbSBEII基因在红薯淀粉生物合成中的作用
植物基因组学——增进我们对植物的了解
近年来，植物基因组学取得了重大进展，研究人员能够识别负责植物生长、发育和逆境反应的基因和基因组区域。2019 年植物基因组学特刊汇集了 57 篇论文，深入探讨了植物基因组学的各个方面，包括基因发现、数量性状位点（QTL）鉴定、基因组预测、基因组编辑、植物叶绿体基因组测序和比较分析、microRNA 分析和比较基因组学。这些研究广泛采用结合生物信息学和转录组分析的综合研究方法来识别响应各种生物和非生物逆境的基因 [ 1 , 2 ]。该方法包括（1）从参考基因组及其注释中全基因组识别所研究的基因家族，对已识别基因进行生物信息学分析，如染色体分布、基因结构、相似性和重复、保守结构域和基序分析以及系统发育分析； (2) 使用来自 Illumina RNA-Seq 测序和/或实时 PCR 分析的转录组数据，对不同胁迫处理下不同发育阶段的不同组织进行表达谱分析，并研究响应研究性状的基因沉默。使用这种方法，在 22 篇论文中，研究了已报道的各种基因家族，以识别响应非生物胁迫、果实成熟、种子发育、种子产量和花粉发育的基因，涉及 12 多个物种，例如番茄、小麦、桉树、烟草、葡萄、拟南芥、番茄、木薯、芜菁、陆地棉、谷子和西瓜。这些基因家族包括2-氧代戊二酸依赖性双加氧酶（2OGD）、细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）、钙依赖性蛋白激酶（CPK）、核转运蛋白β、VQ、水通道蛋白、赤霉酸刺激的拟南芥（GASA）、YABBY转录因子、B3结构域转录因子、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶甲酯酶（PME）、MADS-box转录因子、WRKY转录因子、teosinte-branched 1/cycloidea/增殖（TCP）转录因子、III类过氧化物酶（POD）、糖苷水解酶家族1β-葡萄糖苷酶、RNA编辑因子、蛋白磷酸酶（PP2C）、LIM、油菜素类固醇信号激酶（BSK）和查尔酮合酶（CHS）。微小RNA（miRNA）是一类小RNA分子，在基因表达中发挥着重要的调控作用。两篇论文探讨了miRNA在不同植物物种中的作用。第一篇论文开发了一种人工miRNA前体系统，可以在拟南芥和水稻中高效克隆和沉默基因。该系统可以成为这些作物功能基因组学研究的宝贵工具[3]。第二篇论文鉴定并描述了亚麻籽（一种重要的油料作物）正在发育的种子中的miRNA[4]。结果表明，miRNA 在种子发育过程中发挥着重要作用，可以作为作物改良的靶标。总体而言，这些研究有助于我们了解 miRNA 在植物生长发育中的调控作用，并有望应用于作物改良。GWAS 已广泛用于识别与植物重要性状相关的 QTL 或数量性状核苷酸 (QTN)。本期的一篇精彩论文是关于与西瓜驯化相关的瓜氨酸变异的 GWAS 匹配单倍型网络 [ 5 ]。该论文确定了控制瓜氨酸合成的基因组区域，瓜氨酸是一种非蛋白氨基酸，在植物的生长发育中起着至关重要的作用。