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不含转移 DNA 的碱基编辑柑橘植物的生成
为了以最有效的方式恢复转基因柑橘植株，使用选择标记基因至关重要。在这项研究中，结果表明，将乙酰乳酸合酶 (ALS) 基因的突变形式与添加到选择培养基中的除草剂选择剂伊玛莠平 (IMZ) 结合使用可以实现这一目标。这种方法能够开发顺式基因再生体，即不掺入目前用于转基因选择的细菌基因的植株，此外，它还允许生成经过编辑的非转基因植株，这些植株的内源性 ALS 基因发生了改变，从而产生 IMZ 抗性。在这项研究中，将外植体与携带与 T-DNA 中的 nSpCas9 融合的胞苷脱氨酶的农杆菌共培养，并在添加了 IMZ 的培养基中选择再生体，从而恢复了柑橘突变体，其中 ALS 已使用碱基编辑器系统转化为 IMZ 抗性形式。对无转基因植物的分析表明，T-DNA 基因的瞬时表达足以诱发 ALS 突变，从而以 11.7% 的频率产生 IMZ 抗性芽。据我们所知，这是第一份关于无 T-DNA 编辑柑橘植物的报告。虽然需要进一步优化以提高编辑效率，但这种方法将允许生成具有改进的感官/农艺特征的新柑橘品种，而无需使用外来基因。
两种紧凑型 Cas9 直系同源物胞嘧啶碱基编辑器扩大了 DNA 靶向范围以及体内外应用
基于 CRISPR/Cas9 的碱基编辑工具可实现精确的基因组安装，并为基因治疗带来巨大希望，而 Cas9 核酸酶的大尺寸、其对特定原间隔区相邻基序 (PAM) 序列的可靠性以及靶位偏好限制了碱基编辑工具的广泛应用。在这里，我们通过将胞嘧啶脱氨酶与来自 Streptococcus_gordonii_str._Challis_substr._CH1 (ancSgo-BE4) 和 Streptococcus_thermophilus_LMG_18311 (ancSth1a-BE4) 的两个紧凑的密码子优化的 Cas9 直系同源物融合来生成两个胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)，它们比化脓性链球菌 (SpCas9) 小得多，分别识别 NNAAAG 和 NHGYRAA PAM 序列。这两种 CBE 在胞嘧啶碱基编辑中都表现出高活性、高保真度、不同的编辑窗口和低副产物，并且在哺乳动物细胞中 DNA 和 RNA 脱靶活性极小。此外，在我们测试的靶位点上，这两种编辑器都表现出与两种基于 SpCas9 工程变体（SpCas9-NG 和 SpRY）的 CBE 相当或更高的编辑效率，它们与 ancSgo-BE4 或 ancSth1a-BE4 的 PAM 序列完美匹配。此外，我们通过 ancSgo-BE4 和 ancSth1a-BE4 成功生成了两种在 Ar 基因处带有临床相关突变的小鼠模型，它们在创始小鼠中表现出雄激素不敏感综合征和/或发育致死性。因此，这两种新型 CBE 拓宽了碱基编辑工具包，分别扩大了靶向范围和窗口，以实现有效的基因修饰和应用。
大规模基因组和转录组测序分析揭示了植物中高活性腺嘌呤碱基编辑器诱导的突变景观
摘要背景：利用最近开发的 tRNA 腺苷脱氨酶 (TadA8e 和 TadA9) 改造的高活性腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 表现出强大的碱基编辑活性，但引发了人们对脱靶效应的担忧。结果：在本研究中，我们对 ABE8e 和 ABE9 诱导的水稻 DNA 和 RNA 突变进行了全面评估。对用四种 ABE（包括 SpCas9n-TadA8e、SpCas9n-TadA9、SpCas9n-NG-TadA8e 和 SpCas9n-NG-TadA9）转化的植物进行全基因组测序分析表明，含有 TadA9 的 ABE 导致更多数量的脱靶 A 到 G (A>G) 单核苷酸变体 (SNV)，而含有 CRISPR/SpCas9n-NG 的 ABE 导致水稻基因组中脱靶 SNV 总数更高。对携带 ABE 的 T-DNA 的分析表明，在 T-DNA 整合到植物基因组之前和/或之后可以引入靶向突变，在 ABE 整合到基因组之后会形成更多的脱靶 A>G SNV。此外，我们在 ABE 表达高的植物中检测到脱靶 A>G RNA 突变，但在 ABE 表达低的植物中未检测到。脱靶 A>G RNA 突变倾向于聚集，而脱靶 A>G DNA 突变很少聚集。结论：我们的研究结果表明 Cas 蛋白、TadA 变体、ABE 的时间表达和 ABE 的表达水平对水稻中的 ABE 特异性有影响，这为了解 ABE 的特异性提供了见解，并提出了除改造 TadA 变体之外增加 ABE 特异性的其他方法。
通过碱基编辑环化外显子的反向剪接位点敲除环状RNA
引言与连接上游 5′ 剪接位点 (ss) 和下游 3′ ss 的经典剪接不同，反向剪接将下游 5′ 反向剪接位点 (bss) 与上游 3′ bss 连接，产生共价闭合的环状 RNA (circRNA) [1-7]。尽管反向剪接的加工方式不利，但它由与经典剪接相同的剪接体机制催化 [8-10]，表明它们之间存在直接竞争 [11]。此外，反向剪接也受顺式元件和反式因子的严格调控 [10,12-16]，导致 circRNA 在所检测的广泛细胞系、组织和物种中呈现时空表达 [17-25]。越来越多的证据表明，circRNA 表达失调与人类疾病有关，如癌症 [ 26 – 29 ]、系统性红斑狼疮 [ 30 ] 和神经元变性 [ 31 , 32 ]，表明它们在生理和病理条件下都发挥着潜在作用 [ 1 , 2 , 5 ]。从机制上讲，大多数 circRNA 位于细胞质中，有些被发现充当 miRNA 或蛋白质的诱饵 [ 12 , 15 , 19 , 22 , 30 , 32 , 33 ]。尽管如此，大多数 circRNA 的生物学意义仍未被充分探索，部分原因是其功能研究方法有限，例如 DNA 水平上的 circRNA 敲除 (KO)。例如，CRISPR/Cas9 基因组编辑去除了
人类多能干细胞的碱基编辑用于模拟长 QT 综合征
规则，必须为20nt+PAM形式，突变位点在sgRNA编辑窗口2-8内，获得符合基因编辑条件的治疗靶点。为避免基因编辑过程中的旁观者编辑，我们建议仅对sgRNA编辑窗口2-8内的一个突变位点进行编辑。其他数据库如ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）也是推荐的。
腺嘌呤碱基编辑介导的外显子跳跃在培养猪细胞中诱导基因敲除
在存在原间隔区相邻基序 (PAM) 序列的情况下，ABE 可用于将猪基因组中特定位置的 A·T 转换为 G·C，从而模拟单碱基突变引起的遗传疾病（Anzalone 等人，2020 年；Porto 等人，2020 年）。然而，基因敲除需要将起始密码子 ATG 转换为 GTG（或将 ATG 转换为
应用碱基编辑治疗β-血红蛋白病
本报告包含《1995 年私人证券诉讼改革法》所定义的前瞻性陈述。此类前瞻性陈述包括以下方面的陈述：临床前研究和研发计划的启动、时间安排、进展和结果，包括我们产品线的推进，包括 BEAM-101 和 BEAM-102 的推进；以及我们技术的治疗应用和潜力，包括我们通过碱基编辑为患者开发终身、治愈性、精准基因药物的潜力，所有这些都受已知和未知的重要风险、不确定性和其他因素的影响，这些因素可能导致我们的实际结果、业绩或成就、市场趋势或行业结果与此类前瞻性陈述所表达或暗示的结果存在重大差异。因此，本文中包含的任何非历史事实陈述都可能是前瞻性陈述，应按此类陈述进行评估。在不限制前述条款的情况下，“预期”、“预计”、“建议”、“计划”、“愿景”、“相信”、“打算”、“项目”、“预测”、“估计”、“目标”、“预测”、“潜在”、“应该”、“可以”、“会”、“可能”、“或许”、“将”及其否定词和类似词语和表达旨在识别前瞻性陈述。每项前瞻性陈述都受重大风险和不确定性的影响，这些风险和不确定性可能导致实际结果与该陈述中表达或暗示的结果存在重大差异，包括但不限于与以下方面相关的风险和不确定性：我们开发、获得监管部门批准和商业化我们候选产品的能力，这可能需要比计划更长的时间或花费更多；我们筹集额外资金的能力，但可能无法获得；我们为产品候选物获得、维持和执行专利和其他知识产权保护的能力；COVID-19 疫情的潜在影响；我们候选产品的临床前测试以及临床前研究和临床试验的初步或中期数据可能无法预测正在进行或后续临床试验的结果或成功；我们临床试验的启动和招募可能比预期的要长；我们的候选产品可能会遇到制造或供应中断或失败；与竞争产品相关的风险；以及“风险因素摘要”和“风险因素”标题下以及我们截至 2020 年 12 月 31 日的年度报告 10-K 表、截至 2021 年 3 月 31 日的季度报告 10-Q 表、截至 2021 年 6 月 30 日的季度报告 10-Q 表、截至 2021 年 9 月 30 日的季度报告以及随后向美国证券交易委员会（“SEC”）提交的任何文件中确定的其他风险和不确定性，这些文件可在美国证券交易委员会网站 www.sec.gov 上查阅。更多信息将通过我们的年度和季度报告以及我们不时向美国证券交易委员会提交的其他文件提供。这些前瞻性陈述仅代表截至本陈述之日的观点。可能导致我们的实际结果不同的因素或事件可能不时出现，我们不可能预测所有因素或事件。除非适用法律另有规定，否则我们不承担更新任何前瞻性陈述的义务，无论是由于新信息、未来发展还是其他原因。
使用工程化的 CRISPR RNA 引导胞苷脱氨酶对结核分枝杆菌进行可编程碱基编辑
耐多药结核分枝杆菌 ( Mtb ) 感染严重危害全球人类健康，迫切需要新的治疗策略。高效的基因组编辑工具有助于识别参与细菌生理、发病机制和耐药机制的关键基因和途径，从而有助于开发耐药结核病的新疗法。在这里，我们报告了一个双质粒系统 MtbCBE，用于灭活基因并在 Mtb 中引入点突变。在该系统中，辅助质粒 pRecX-NucS E107A 表达 RecX 和 NucS E107A 以抑制 RecA 依赖性和 NucS 依赖性的 DNA 修复系统，碱基编辑质粒 pCBE 表达结合胞苷脱氨酶 APOBEC1、Cas9 切口酶 (nCas9) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (UGI) 的融合蛋白。这两个质粒共同实现了结核分枝杆菌基因组中所需位点处 G:C 到 A:T 碱基对的有效转换。碱基编辑系统的成功开发将有助于阐明结核分枝杆菌致病机理和耐药性的分子机制，并为开发其他微生物的碱基编辑工具提供重要启发。
高纯度生产和DNA碱基编辑核糖核蛋白的精确编辑
核糖核蛋白（RNP）复合物介导的碱基编辑预计将非常有益，因为与质粒或病毒载体介导的基因编辑相比，其具有脱靶效应，尤其是在治疗应用中。但是，在细菌系统中产生丰富的产量和高纯度的重组胞嘧啶基础编辑器（CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（ABES）的生产具有挑战性。在这里，我们从人类细胞表达系统中获得了高度纯化的CBE/ABE蛋白，并且表明CBE/ABE RNP表现出不同的编辑模式（即，与质粒编码的CBE/ABE相比，CBE/ABE的转化率较小（即，多个碱基与单个碱基的转化率较小），主要是导致细胞中RNP的寿命有限的原因。此外，我们发现与质粒编码的ABE相比，ABE RNP的DNA和RNA的脱靶效应大大降低。我们最终将NG PAM – tarbetable -abe RNP应用于视网膜变性12（RD12）模型小鼠中的体内基因校正。