将每个细胞悬浮液添加到包含0.5 mM玻璃珠的2 mL管中(CAT#19-622)。然后以3、4和5的速度在Omni珠子破裂4(CAT#25-010)中均匀地均匀,持续45秒。加工后,将裂解物转移到清洁2毫升试管中,并以10,000 x g离心1分钟,以弥补任何细胞碎屑。使用Quick-DNA™真菌/细菌微型REIPREP试剂盒(Zymo,Cat#D6005)1 µL DNA洗脱器在纳米光谱表(Thermo Fisher)上量化1 µL DNA洗脱器,以确定DNA浓度和纯度。
本协议描述了通过生命HMW DNA提取方案制备的样品中的HMW DNA的离心介导的HMW DNA片段化。该协议使用Covaris g-tube产生8–10 kb尺寸范围的片段。剪切的DNA适用于下游长读取测序,包括超低输入(ULI)库制备后的PACBIO测序。这个过程对于生命树计划中所有分类学组的DNA提取物非常有效。该协议的输出是剪切的DNA,可以使用手动或自动SPRI协议将其针对碎片的DNA清除。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用不含钙和镁的PBS洗涤它们。将T25活塞3-5毫升PBS和T75活塞使用5-10毫升。然后将细胞完全用ACCUTASE覆盖,其中T25活塞的1-2 mL和T75活塞的2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以更换它们。孵育后,将细胞与10 ml培养基仔细混合以使它们共振,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,在新鲜培养基中产生共鸣,并将其转换为已经包含新鲜培养基的新活塞。
在CTS细胞平衡软件的控制下,用CTS可拆卸Dynabeads CD3/CD28和CTS DynaceLlect系统从四分之一的Leukopaks分离出T细胞。隔离后,用慢病毒载体反式诱导细胞,以编码CD19靶向的汽车基因,其感染(MOI)为2。24小时后,使用CTS DynAceLect系统和CTS可分离的Dynabeads释放缓冲液,将CAR-T细胞与CTS可拆卸的Dynabead分离。然后使用GIBCO CTS ROTEA™逆流离心系统洗涤这些CAR-T细胞,而分离的CTS可拆卸Dynabeads CD3/CD28珠子被CTS DynAceLlect系统捕获。
1。将多达200毫克的凳子样品添加到珠管中,然后将管子放在冰上。-Note:如果样品干燥,则将样本量降低至≤50mg。 - 注意:如果样品是液体,则将200 µL样品添加到珠管中。2。将300 µL的SDE1缓冲液和20 µL蛋白酶K加入样品。以最大速度涡旋5分钟。在孵育过程中将样品混合物在60°C下孵育20分钟,每5分钟涡流一次。- 确保粪便样品完全匀浆。- 为了从革兰氏阳性细菌中分离DNA,需要在蛋白酶K裂解后在95°C下额外孵育5分钟。3。简要旋转管以去除盖子内部的滴。4。冷却样品混合物,并加入100 µL SDE2缓冲液。通过涡旋充分混合并在冰上孵育样品混合物5分钟。5。全速离心5分钟。6。小心地将上清液转移到1.5 mL微输出管(未提供)并丢弃凳子颗粒。- 避免移除任何碎屑和颗粒。7。加入200 µL的SDE3缓冲液。通过涡旋充分混合并在室温下孵育样品混合物2分钟。- 注:SDE3缓冲液必须在每次使用前都会急剧涡旋。- 切断1 ml尖端的末端,以使移动SDE3缓冲区更容易。8。全速离心2分钟。9。小心地将250 µL上清液转移到1.5 mL微输出管(未提供)。- 避免移除任何碎屑和颗粒。
- 0.5 mL的麻醉剂是从一个麻醉剂样本中抽出的,并将0.2 µm的过滤器推入单独的管中,从而导致0.25 mL过滤的麻醉液 - 将0.75 mL的MQ水添加到过滤后的麻醉管中,从而导致1:3比例的1:3比例。- 在13.4 rpm的情况下,将过滤后的麻醉管放置在离心机中15分钟。- 将离心麻醉的10 µl移动到乙醇清洁的玻璃显微镜载玻片上 - 将显微镜载玻片放在70°C的热板上,将一根空气管放在一个热板上,吹过一管,穿过18 g的针头,位于样品
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
亚培养从粘附细胞中去除旧培养基,并用无钙和镁的PBS洗涤它们。使用3-5毫升PBS进行T25瓶,T75瓶子使用5-10毫升。然后用电池完全覆盖电池,用1-2 mL盖住T25瓶,T75瓶的2.5毫升。让细胞在室温下产生8-10分钟,以松开它们。孵育后,将细胞与10 ml培养基仔细混合,以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。扔掉上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。