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HLA-A/B/C敲除电穿孔套件
说明HLA-A/B/C敲除电穿孔套件适用于通过电穿孔的细胞系和原代T细胞工程。该套件既包含Cas9酶（链球菌）和靶向HLA-A/B/C（人白细胞抗原）的GRNA。该套件足以设计高达500万个原代T细胞。背景HLA（人白细胞抗原）-a，b和c是MHC的三种主要类型（主要的组织相容性复合物）1类跨膜蛋白。它们与β2微球蛋白蛋白（由B2M基因编码）形成异二聚体。MHC 1类分子表现出短多肽，通常在长7-11个氨基酸之间，以识别为“自我”或“非自身”的免疫系统。HLA-C存在于所有细胞中，并且由于HLA-C基因的多样性而作为几种单倍型存在。c*08：02代表一种这样的单倍型。HLA I类将新抗原衍生的肽呈现到细胞表面，从而通过TCR（T细胞受体）识别出T细胞的识别。 癌症免疫疗法一直在使用该机制，方法是表达能够识别特定癌症免疫原子的TCR。 在2016年，HLA-C*08：02限制性TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）在肺癌中靶向KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）G12D突变，导致阳性结果。 在转移性胰腺癌患者中采用了类似的方法，并导致该疾病的消退。 HLA-C*08：02限制性TIL对其他新抗原的TCR的研究可能对癌症治疗有益。 应用程序HLA I类将新抗原衍生的肽呈现到细胞表面，从而通过TCR（T细胞受体）识别出T细胞的识别。癌症免疫疗法一直在使用该机制，方法是表达能够识别特定癌症免疫原子的TCR。在2016年，HLA-C*08：02限制性TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）在肺癌中靶向KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）G12D突变，导致阳性结果。在转移性胰腺癌患者中采用了类似的方法，并导致该疾病的消退。HLA-C*08：02限制性TIL对其他新抗原的TCR的研究可能对癌症治疗有益。应用程序K562细胞是HLA I和II类负的，使其成为引入和研究特定单倍型响应的理想细胞模型。hla在供体细胞和个体之间的不匹配可以导致免疫排斥反应，一种选择是敲除内源性HLA，从而使细胞被更广泛地普遍使用。
无标记代谢成像增强嵌合抗原受体T细胞治疗的疗效
标题：无标记代谢成像增强嵌合抗原 1 受体 T 细胞治疗的疗效 2 3 作者： Dan L. Pham 1,2†、Daniel Cappabianca 1,3†、Matthew H. Forsberg 4、Cole Weaver 1,2、4 Katherine P. Mueller 5、Anna Tommasi 1,3、Jolanta Vidugiriene 6、Anthony Lauer 6、Kayla Sylvester 6、5 Madison Bugel 1,3、Christian M. Capitini 4,7、Krishanu Saha 1,3*、Melissa C. Skala 1,2* 6 7 附属机构： 8 1 威斯康星大学麦迪逊分校生物医学工程系；美国威斯康星州麦迪逊 9。 10 2 莫格里奇研究所；美国威斯康星州麦迪逊。 11 3 威斯康星大学麦迪逊分校威斯康星发现研究所；美国威斯康星州麦迪逊 12 4 威斯康星大学医学与公共卫生学院儿科系；13 美国威斯康星州麦迪逊。 14 5 宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院肿瘤学部儿科系；15 美国宾夕法尼亚州费城。 16 6 Promega 公司；16 威斯康星州菲奇堡。 17 7 威斯康星大学麦迪逊分校威斯康星大学卡博内癌症中心；17 美国威斯康星州麦迪逊。 18 20 † 这些作者对本文贡献相同 21 * 通讯作者：ksaha@wisc.edu ，mcskala@wisc.edu 22 23 摘要：24 25 嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法治疗实体瘤不仅因为免疫抑制肿瘤微环境具有挑战性，还因为其制造过程复杂且难以监控。制造直接影响 CAR T 细胞的产量、表型和代谢，这些与体内效力和持久性相关。特别是，尽管代谢适应性是一项关键的质量属性，但 T 细胞代谢需求在整个制造过程中如何变化仍未得到探索。在这里，我们使用光学代谢成像 (OMI) 解决了这一限制，这是一种基于自发荧光代谢辅酶 NAD(P)H 和 FAD 评估单细胞代谢的非侵入性、无标记方法。使用 OMI，我们确定了培养基组成相对于抗体刺激和/或细胞因子的选择对抗 GD2 CAR T 细胞代谢、活化强度和动力学以及表型的主要影响。我们证明 OMI 参数可以指示病毒转导和基于电穿孔的 CRISPR/Cas9 的细胞周期阶段和最佳基因转移条件。值得注意的是，在 37 无病毒 CRISPR 编辑的抗 GD2 CAR T 细胞模型中，OMI 测量可以准确 38 预测氧化代谢表型，从而产生更高的体内抗神经母细胞瘤效力。我们的数据支持 OMI 作为一种强大、灵敏的分析工具的潜力，可以识别 40 最佳制造条件并在整个制造过程中监测细胞代谢，从而提高 41 CAR T 细胞产量和代谢适应性。42 43
同种异体困境深层前层角膜成形术（...
健康的角膜上皮不断被源自角膜缘角膜层状干细胞的细胞更新[1]。几种病理条件会损害这些细胞，导致干细胞缺乏症（LSCD），其中纤维血管结膜上皮取代了甲状腺上皮细胞。一小部分的边缘干细胞可能足以使整个角膜上皮化[2]。LSCD可能发生在先天性厌氧菌中，在重复的眼科手术后对边缘的热或化学损害后创伤后发生，或与眼表面的慢性炎性疾病有关。LSCD经常导致受影响的眼睛的功能失明[3]。除了表面不透明度和复发性上皮缺陷外，这些患者还经常还具有质状疤痕，稀疏或角膜穿孔的经常性基质溃疡[4，5]。如果传统的穿透性角化膜成形术是在与基质病理和LSCD结合的眼睛中进行的，则很可能对最初清晰的移植物的结膜化，角膜内皮恢复和随后的移植失败。在LSCD中，必须嫁接边缘干细胞或替代性表演干细胞，以确保角膜表面足够的上皮覆盖范围。同种异体穿透性中央环境成形术使用供体角膜的分散式三角形成移植物，该移植物包含额外的边缘组织几个时钟小时[6-8]。这种方法首先由Sundmacher和Reinhard等人在1996年描述。并在接下来的几年中进一步发展。我们命名[6-8]具有长达40％圆周的一个新月形边缘区域的供体组织将其集中植入受体的角膜中[1，6，7]。在这种移植后，拒绝通常不仅对移植的边缘干细胞，而且还会发生在同种异体角膜内皮上，即使进行全身免疫抑制治疗也是如此[1，9]。在过去的20年中，在许多地区，各种适应症的层状角膜移植数量稳步增加[10]。层状程序，例如降落剥离自动内皮角膜造口术（DSAEK），降落膜膜内皮性角膜膜成形术（DMEK）（DMEK）或深层层状角膜置换术或深层层状角化膜成形术（DALK）提供了超过渗透性的依从性依赖的依从性的（dalk），该依赖的陪伴下层的陪伴下层，并获得了陪伴的陪伴。角膜疾病。Dalk比PK的优势是术后较高的内部细胞计数，并且由于缺乏内皮排斥而导致内皮失代偿的风险较低[11-13]。一份病例报告描述了两种情况下的双侧边缘干细胞缺乏症的深层前层状环膜成形术。然而，使用了直径11至11.5 mm的移植物，其中包括整个角膜，包括边缘[14]。我们假设一种替代性的，甚至更多的组织较高的方法，其中选择了正常的移植直径，类似于困境角化膜成形术技术，同时保留了患者自己的内皮。这确保了在伤口愈合的初始阶段，通常对通常的血管巩膜和结膜有所不同，这伴随着炎症活性的增加。此外，这种方法允许在即将发生的角膜锻炼的紧急情况下进行更安全的解剖，其中广泛的大直径角膜剖定增加了降膜膜的穿孔风险。我们提出，在保留受体的健康内皮细胞的同时，在执行Limbo-kerato-plasty时，内皮失代偿率较低。
主题：羊膜和缘干细胞移植，用于治疗眼部条件
摘要和证据分析：有或不带有缝合线和边缘干细胞移植的人类羊膜移植已有多年用于治疗眼科条件。这些条件中的许多条件很少，导致进行RCT的困难。角膜溃疡和熔体很常见和可变，并且预计不会有其他RCT。在角膜移植后发生主动炎症时，未发现角膜穿孔的证据，需要进行辅助治疗。Khokhar等人（2005年）报道了30例（30眼）患有难治性神经营养的角膜溃疡的RCT，这些患者被随机地进行HAM移植（n = 15）或用tar骨或绷带接触镜头进行常规治疗。在3个月的随访中，HAM组中有73％的患者表现出完全上皮化，而常规组中有67％的患者。Suri等人（2013年）报道了11例没有对常规治疗反应的神经营养性角膜病患者的眼睛。Prokera插入之前的平均治疗持续时间为51天。11例患者中有5名（45.5％）被认为取得了成功。Liu等人（2019年）对角膜溃疡的17项研究（390眼）进行了系统的综述。除1项研究外，所有研究都是在美国以外进行的。有30名患者有1个RCT，其余的研究为前瞻性或回顾性病例系列。角膜愈合。完整的上皮化发生更快，并且在更多的患者中达到了。在报告视力的12项研究（222眼）中，113只眼睛（53％）提高了视力改善率。yin等人（2020年）比较了24例角膜感染性溃疡患者的上皮化和视觉结局，并且视力少于20/200，他们接受了（n = 11）或没有（n = 13）自固定的羊膜膜的治疗。在2018年在其机构中启动了羊膜的利用，从而可以对2个治疗组进行回顾性比较。Suri等人（2013年）还报道了33例33例患者的35只眼睛，这些患者接受了各种眼部表面疾病治疗的患者。九只眼睛有未愈合的角膜溃疡。在有此适应症的9例（22％）患者中有2名（22％）中看到了完全或部分成功。Keirkhah等人（2008年）报道说，在9例有边缘干细胞缺乏缘的患者中使用火腿。患者进行了表面角膜切除术，以去除结膜化的pannus，然后使用纤维蛋白胶进行HAM移植。在7例患者中使用了另外的prokera斑块。除2例患者外，所有人都观察到了视力的提高。Pachigolla等人（2009年）报道了一系列20例接受过眼表面疾病的植入物的患者。 6例患者有水缘干细胞缺乏症，具有化学灼伤史。用Prokera治疗后，6例患者中有3名具有光滑的角膜表面，并将视力提高到20/40。其他3例患者的最终视力为20/400，手指计数或光感知。症状已经存在大约2年。dos Santos Paris等人（2013年）发表了一份RCT，将新鲜的火腿与基质穿刺进行了比较，以治疗大胆的角膜病患者的疼痛。在等待角膜移植或没有眼睛看不见的眼睛的四十例患者患有乳腺癌的疼痛患者被随机分为两种治疗方法。ham在最多180天的随访中导致了更常规的上皮表面，但是与公牛的存在或严重程度或疼痛持续时间有关的处理之间没有差异。由于对疼痛的影响类似，作者建议初始使用较简单的基质穿刺程序，仅在疼痛无法解决的情况下使用HAM。Sharma等人（2016年）进行了一个RCT，该RCT分配了25名患者（50
孵化器原理和应用程序
实验室孵化器是一种旨在为微生物增长的控制环境的设备，使科学家可以研究和培养各种类型的细菌，霉菌和酵母。该设备以热电的原理运行，其中热能通过保持一致温度的恒温器转化为电能。不同微生物的理想温度各不相同，嗜嗜性细菌需要37℃，霉菌和酵母需要28°。孵化器的温度控制系统依赖温度传感器，控制器和承包商来确保精确的温度调节。实验室孵化器具有不同的零件，包括内部由铝制成的双壁柜和外部不锈钢，用玻璃羊毛隔热以防止热量损失。存储容量的范围从20升到800升。门具有视觉观察的玻璃，并由石棉垫圈密封，以维持气密的环境，防止热空气逃生和非紧密空气进入。控制面板位于机柜外部，并包含用于控制孵化器的各种参数的开关，包括通过恒温器进行温度设置。一些孵化器配备了HEPA过滤器，湿度和CO2控制系统，提供了一个闭环环境，以最大程度地减少污染风险。根据其大小和目的，实验室孵化器可以分类为冷却或冷藏类型，这些类型可提供精确的温度控制和空气循环风扇，以维持房间内的新鲜度。2。3。4。5。这些先进的特征在生物学和微生物学研究环境中至关重要，在研究微生物中，需要精确的环境条件。孵化器在实验室环境中起着至关重要的作用，通过为各种生物文化的增长和维护提供受控的环境。可以使用不同类型的孵化器，每种孵化器都满足特定需求，例如保持温度在20-25°C之间的低温孵化器，控制水分水平的湿度孵化器以及模仿某些微生物所需的无氧环境的CO2孵化器。摇动孵化器将运动/动摇功能与温度和湿度控制相结合，非常适合分子生物学和遗传学应用。台式/标准孵化器是最常见的类型，提供了从环境到100℃的宽温度范围，使它们成为微生物学，动物学和医疗实验室的多功能工具。使用孵化器时，至关重要的是遵循安全指南，例如避免不必要的门开口，保持适当的温度设置以及定期清洁以防止污染。维持微生物生长环境条件的最佳条件至关重要。孵化器中的热电机理维持各种应用的稳定参数 - 微生物培养物，细胞生长或温度敏感的过程。玻璃羊毛绝缘材料可减少能源使用，同时保持稳定的内部环境。6。7。玻璃羊毛隔热材料可减少热量损失和电力消耗，而架子在内壁上的内向延伸支持。门具有一个绝缘设计，带有一个玻璃面板，可在不打开的情况下观看，并带有一个易于操纵的手柄，控制面板在外墙和房屋的开关和指示器上进行了启动，包括固定式固定量。调整。穿孔的架子允许热空气流通，而在某些型号中可拆卸的架子有助于彻底清洁。AsbestosDoor垫片在机柜和门之间提供近水密封，防止外部空气浸润并保持隔离状态。湿度和气体控制机制调节内部的相对湿度和二氧化碳浓度。控制面板具有各种开关和指标，用于精确管理温度和湿度等参数。Inner投影支持架子，确保适当地放置培养基。用于实验室使用的孵化器：类型，功能和操作程序有各种类型的实验室孵化器可用，每种培养箱都旨在满足特定的需求和需求。用于温度监测--------------------------------------高级型号具有HEPA过滤器，以减少气流的污染，从而创建一个闭环系统，用于内部清洁空气。湿度和气体控制器还使用水库调节二氧化碳水平。实验室中的孵化器类型-------------------------------------------------------------------------- 1.8。9。冷却的孵化器：通过内部冷却系统和精确的温度调节，将温度保持在环境条件以下。摇动孵化器：结合了搅拌和温度控制，以实现最佳细胞发育，尤其对细菌培养和酵母生长有用。便携式孵化器：在偏远位置进行微生物测试，从而降低了运输过程中样本恶化的风险。台式孵化器：从室温到100°C，带有警报和带有时间和温度显示屏的玻璃门。二氧化碳孵化器：创建与人体环境相似的条件，保持37°C的温度，湿度超过90％，并且用于生物细胞培养的中性pH值。BOD孵化器：保持20-25°C之间的温度，非常适合生长酵母，霉菌和生物氧需求测试。光孵化器：模拟种子和植物的自然生长条件，同时进行各种材料的光稳定性测试。厌氧孵化器：创建无氧环境，对于培养挑战性厌氧生物所必需的无氧环境。恒定的温度和湿度孵化器：利用精确的控制系统来创建生物技术测试和工业研究所需的各种环境模拟条件。10。模拟孵化器：最简单的选项，尽管精确且缺少显示板以显示实际的腔室温度。11。数字孵化器：更昂贵但用户友好的设备，具有卓越的精度，并具有显示实时室内温度读数的显示板。2。3。4。5。孵化器的操作程序--------------------------------------------------------------- 1。电源：在进行任何操作之前，请确保与电源插座的安全连接。主电源开关：将其打开以开始计算机的初始化过程。红色功率旋钮：将此控件从0位置旋转到1，以正确激活系统。冷却机制：将冷却拨盘从位置0转到1以进行适当的温度调节。温度校准：通过使用“设置点-1”设置下较低温度将较低温度设置为21°C，同时用螺丝刀调整螺钉和RST螺钉。6。上限设置：按“设置点-2”将23°C建立为上阈值，同时修改设置/rst螺钉。7。温度监测：每天，早晨和晚上两次保持温度的适当记录，以获得最佳结果。实验室孵化器的使用在各个领域都广泛。这些设备为生长的微生物提供了最佳条件，并保持了长时间的生存能力。它们还用于生化研究，晶体发育，组织培养和环境监测。要有效地操作孵化器，必须执行操作前检查以确保从腔室中删除以前的项目，除非需要同时培养需要相同参数的多种生物体。在打开之前，应牢固地关闭门，并适当加热到通过温度计验证的所需温度。需要量身定制孵化周期，以满足最佳微生物生长的特定要求。参数构型可以为特定的二氧化碳浓度和湿度水平设置，如果需要特定的生物体生长。一些孵化器通过用胶带密封板来提供扩展的孵化，或者在最后的门锁和时机之前将其放在塑料容器中。这些仪器用于各种应用，例如微生物培养，培养，增强生长，生化研究，动物学应用，样品保存，食品分析，药物研究和晶体发展。实验室孵化器的优势包括能源效率，参数定制和环境稳定性。但是，它们也有诸如门管理之类的局限性，该局限性需要仔细处理以防止对存储的样品的污染风险，并且参数限制，这意味着只能一次在特定的环境条件下维持不同的文化。设备需要大量的金融投资和熟练的人员，以进行适当的运营和维护程序。预防措施以在扩展操作期间维持无菌环境，包括在孵化器架子下倒无菌水，以防止培养基变干。适当的参数监视对于确保在将培养板放置在机柜内之前确保所有必要的生长参数是必不可少的。这有助于为生物体开发创造最佳条件。培养板应始终将盖子放在底部的盖子上，以防止水冷凝到培养基表面上。定期清洁孵化器的内部对于防止有机体定居在货架上或在设备的拐角处收集至关重要。温度稳定性至关重要，应避免频繁的门开口，因为它可以显着影响机柜内部的细菌生长和发育。由于微生物敏感性，保持稳定的环境条件也很重要。必须在将培养板放入内阁之前建立和稳定。此外，必须采取凝结预防措施，例如倒置在底部的盖子倒置，以防止水凝结到生长培养基上。定期维护孵化器的内部，可以防止有害的生物体定居在表面和角落。在扩展操作过程中放置无菌水的位置也有助于维持媒体水分。导致不规则或不成功的孵化，至关重要的是要注意，卵孵育的理想温度可能会因孵化的卵种而异。例如，某些爬行动物和鸟类可能需要比鸡蛋的温度更高或较低。操作员应彻底研究其孵化的鸡蛋的特定温度要求，以确保将孵化器设置在正确的温度下。孵化器可以在没有电力的情况下起作用的持续时间取决于孵化器类型，鸡蛋阶段和环境温度等因素。但是，扩展的停电会导致卵失去水分，导致异常或失败的孵化。通常，为鸡蛋设计设计的孵化器通常可以承受几个小时而不会造成电力而不会损害鸡蛋的孵化器，前提是环境温度保持适中。在高级发育阶段的鸡蛋可能对温度和湿度波动更敏感，并且更容易受到停电的影响。在这种情况下，必须尽快恢复动力，以保持卵的最佳环境。如果孵化器长时间无电，则可能有必要丢弃鸡蛋并从新鲜的鸡蛋开始。氧气对于孵化器内的卵发育至关重要。卵内的胚胎使用氧作为生长和发育的能量来源。没有足够的氧气，胚胎可能无法正常发育，并且可能经历异常或失败的孵化。孵化器旨在为鸡蛋提供控制环境，包括调节氧气水平。大多数孵化器具有通风系统，可循环新鲜空气并保持设备内部的适当氧气水平。值得注意的是，卵孵育的特定氧气需求可能会因物种而异。某些鸡蛋可能需要比其他鸡蛋更高或更低的氧气水平。操作员应研究其孵化的卵的特定氧气需求，以确保最佳环境。孵化器通常不需要直接供水，因为鸡蛋不直接与水接触。但是，保持孵化器内的湿度对于卵发育至关重要。这可以通过控制二氧化碳水平或使用水锅或托盘来实现。后者是一个容器，可容纳水并调节孵化器内部的湿度。在孵化器中，水锅或托盘有助于保持理想的湿度水平。该水源应在孵化器内部蒸发并增加湿度时保持充足。特定的湿度需求因物种而异，因此操作员必须研究其孵化的每种鸡蛋的需求。