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World File Search System紫霉素
CRISPR稳定的敲入细胞生产（CAT。C.C408）案例研究：使用CRISPR将红色荧光蛋白（RFP）基因敲入人类胚胎
图2 PCAS-GUIDE-AAVS1和PAAVS1-RFP-DNR的矢量图。pCAS指向AAVS1是哺乳动物细胞中SGRNA和Cas9共表达的多合一载体。SGRNA的表达是由强大的组成型Pol III启动子U6启动子驱动的。而CMV启动子则驱动CAS9酶的表达。paAVS1-RFP-DNR在CMV启动子下的PGK启动子和RFP基因下表达紫霉素的抗性标记。5'和3'AAVS1同源臂（“ aavs-right”和“ aavs-left”）为单元提供了一个用于同源性修复的模板。
DNA使用Omni Bead Ruptor 12珠磨机均质器从大麻sativa中提取DNA，以进行样品制备。
图4：a）MDA-MB-231细胞被绿色 - 肾上腺胶体易感病毒感染，并使用紫霉素选择了稳定的转导细胞。每周一次通过IVIS系统确定生物发光信号的强度六周。b）用红色葡萄糖和GFP标记的双重标记的MDA-MB-231细胞。可以通过两个FACS分析检测GFP报告基因表达。c）使用Nuance多光谱成像系统测量HT1080细胞中的GFP表达。
使用通用供体
图1。通过MESC中的刺激诱导的插入诱变。（a）击球策略的示意图。通过Cas9 RNP的hit-trap供体和基因组的同时裂解会导致靶向捕获。 整合后，基因陷阱盒会导致靶基因启动子的截短蛋白和GFP的表达。 选择盒子由组成型SV40启动子表达紫霉素的抗性基因。 ATS序列：GGTATGTCGGGAACCTCTCCAGG; SA，剪接受体； IRES，内部核糖体入口网站； PA，聚腺苷酸信号。 （b）在杀击球中选择呼吸霉素后MESC克隆的代表性微观图像。 红色箭头分别指示凋亡克隆（顶部），GFP-生存的克隆（中间）和GFP阳性幸存的克隆（底部）。 比例尺，50 µm。 （c）GFP阳性克隆的PCR基因分型证实了HPRT基因座的hit-trap供体的正确整合。 5 /3J，5' /3'交界处。 （d，e）针对HPRT基因座（TH1-1，TH2-4和TH3-5）的hit-trap克隆的Western印迹和QPCR分析，并用微管蛋白作为负载对照。 错误条显示了S.D. 来自三个技术重复。 使用学生的未配对t检验来计算显着性：** p <0.01。通过Cas9 RNP的hit-trap供体和基因组的同时裂解会导致靶向捕获。整合后，基因陷阱盒会导致靶基因启动子的截短蛋白和GFP的表达。选择盒子由组成型SV40启动子表达紫霉素的抗性基因。ATS序列：GGTATGTCGGGAACCTCTCCAGG; SA，剪接受体； IRES，内部核糖体入口网站； PA，聚腺苷酸信号。（b）在杀击球中选择呼吸霉素后MESC克隆的代表性微观图像。红色箭头分别指示凋亡克隆（顶部），GFP-生存的克隆（中间）和GFP阳性幸存的克隆（底部）。比例尺，50 µm。（c）GFP阳性克隆的PCR基因分型证实了HPRT基因座的hit-trap供体的正确整合。5 /3J，5' /3'交界处。（d，e）针对HPRT基因座（TH1-1，TH2-4和TH3-5）的hit-trap克隆的Western印迹和QPCR分析，并用微管蛋白作为负载对照。错误条显示了S.D.来自三个技术重复。使用学生的未配对t检验来计算显着性：** p <0.01。
人胎盘中合成肌细胞细胞谱系发育的关键调节剂
背景。胎盘是一种瞬态器官，在怀孕期间形成以支持胎儿发育并调节影响慢性疾病风险的环境线索的暴露。胎盘在许多方面支持胎儿发育，包括促进营养和氧气交换，去除有害废物产品，产生关键的激素（例如人类绒毛膜促性腺激素）以及提供免疫保护。这些功能在很大程度上是由被称为合胞素细胞和额外滋养细胞细胞的终末分化的滋养细胞执行的。尽管合成肌细胞细胞和跨性滋养细胞细胞的重要性，但仍不清楚它们如何专门支持最佳胎儿发育。目标。使用功能方法丧失来确定合成肌细胞细胞谱系发育的转录调节因子。方法。候选转录因子（TBX3，VGLL3和ATF3）使用慢病毒介导的短发蛋白RNA（SHTBX3，SHTBX3，SHVGLL3或SHATF3）使用胞质衍生的人滋养细胞干细胞中击倒。将非特异性shRNA（SHCONTROL）用作对照。转导后，使用紫霉素选择细胞，并分别通过RT-QPCR和Western印迹在转录本和蛋白质水平上确认敲低效率。通过功能和转录组评估评估了转录因子敲低对滋养细胞干细胞分化为合成型肉芽细胞的影响。结果。结论。未来的方向。与用SHControl转导的细胞相比，SHTBX3和SHVGLL3的转导在合成型细胞细胞分化后导致形态异常。 可以使用滋养细胞干细胞中的功能方法丧失来评估候选转录调节剂对合成细胞细胞谱系发育的关键贡献。 初步结果表明，TBX3和VGLL3对于建立合成型细胞细胞谱系至关重要。 然而，需要更深入的表征来识别TBX3和VGLL3调节合成细胞成分的发育的分子机制。 未来的研究将包括完成剩余的候选转录因子，ATF3，全基因组评估（例如ATAC-SEQ）的shRNA敲低，以及所有SHRNA转换的其他功能输出，例如人类绒毛膜促性腺激素的产生。在合成型细胞细胞分化后导致形态异常。可以使用滋养细胞干细胞中的功能方法丧失来评估候选转录调节剂对合成细胞细胞谱系发育的关键贡献。初步结果表明，TBX3和VGLL3对于建立合成型细胞细胞谱系至关重要。然而，需要更深入的表征来识别TBX3和VGLL3调节合成细胞成分的发育的分子机制。未来的研究将包括完成剩余的候选转录因子，ATF3，全基因组评估（例如ATAC-SEQ）的shRNA敲低，以及所有SHRNA转换的其他功能输出，例如人类绒毛膜促性腺激素的产生。