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基因治疗和基因组编辑的标准
Judith 是 FDA、CBER 组织和先进疗法办公室 (OTAT) 的国际监管专家。她在 OTAT 的主要职责是促进细胞、组织和基因疗法监管要求的国际协调，并领导 OTAT 监管产品的标准制定活动。在标准方面，她与国家标准与技术研究所和标准协调机构密切合作，以促进先进疗法的标准制定。她代表 FDA 参加 ISO 技术委员会 276、生物技术、ASTM F04 组织工程产品委员会和肠外药物协会标准委员会。她在国际监管要求协调方面的工作包括担任国际药品监管机构计划细胞治疗工作组和基因治疗工作组的秘书处。她是亚太经合组织监管协调小组委员会先进疗法优先工作领域的联合主席，并担任东北大学监管卓越中心和杜克大学医学院-新加坡国立大学监管卓越计划的教员。
用基因组编辑和数字技术开放Mirai
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使用化学发光生物测定法直接免疫检测全局 A-to-I RNA 编辑活性
腺苷到肌苷 (A-to-I) 编辑是一种保守的真核 RNA 修饰，有助于发育、免疫反应和整体细胞功能。RNA 编辑模式在不同细胞和组织类型之间可能存在显著差异，而过度活跃的 A-to-I 特征则表明存在多种疾病，包括癌症和自身免疫性疾病。由于这些差异具有生物学和临床重要性，因此迫切需要有效的方法来测量细胞 RNA 中的整体 A-to-I 编辑水平。当前的标准方法依赖于 RNA-seq 来间接检测编辑位点，这需要大量时间和材料投入以及大量的计算分析。在这里，我们利用核酸内切酶 V (EndoV)（它特异性地与 RNA 中的肌苷结合）来开发基于蛋白质的化学发光生物测定法，以直接分析 A-to-I RNA 编辑活性。我们之前展示了 EndoV 可以在 RNA 测序之前结合并丰富 A-to-I 编辑的转录本，现在我们利用这一活性构建 EndoV 连接免疫吸附测定 (EndoVLISA)，作为一种快速的、基于板的化学发光方法，用于测量细胞 RNA 中的全局 A-to-I 编辑特征。我们首先使用化学合成的寡核苷酸优化和验证我们的测定方法，说明对 RNA 中的肌苷具有高度选择性和灵敏度的检测。然后，我们展示了对处理过的细胞系中肌苷含量的快速检测，证明了与当前标准 RNA 测序方法相当的性能。最后，我们部署了 EndoVLISA 来分析正常和患病人体组织中的差异 A-to-I RNA 编辑特征，说明了我们的平台作为诊断生物测定的实用性。总之，EndoVLISA 方法经济高效、简单易用，并且使用常见的实验室设备，为研究 A-to-I 编辑提供了一种高度可用的新方法。此外，多孔板格式使其成为第一个适用于直接高通量量化 A-to-I 编辑的检测方法，可用于疾病检测和药物开发。
CRISPR/CAS通过同源重组的第3章基因组编辑
在整个细胞发育中，DNA可能遭受威胁基因组完整性和细胞存活的损害。最有害的病变之一是双链DNA断裂（DSB），因为它可能导致基因组信息的丢失。DSB可能自然发生在细胞代谢期间，也可能是由外部因素触发的（Deriano; Roth，2013）。无论哪种方式，这些损坏都会通过细胞立即修复，主要是通过两种途径：非同源末端连接（NHEJ）或同源指导修复（HDR）。与通过NHEJ进行修复不同，NHEJ仅将裂解的DNA的末端连接起来（请参阅第2章），HDR途径需要存在相同或非常相似的模板，即完整的序列，以准确地修复病变的DNA（Heyer等人，2010年）。提供用于HDR中使用的模板的可能性代表了通过同源重组（HR）途径进行基因编辑的关键元素，该途径可能被利用为几种新的繁殖技术（NBT）之一。
花粉数量和核糖体基因表达在花粉数量减少 1 基因的基因组编辑突变体中发生改变
花粉粒的数量在物种内和物种间存在差异。然而，与雄蕊细胞分化方面的研究相比，人们对这一数量性状的分子基础知之甚少。最近，通过拟南芥的全基因组关联研究，分离出了第一个负责花粉数量变异的基因 REDUCED POLLEN NUMBER1 (RDP1)，并表现出自然选择的特征。该基因编码酵母 Mrt4 (mRNA 转换 4) 的同源物，它是大核糖体亚基的组装因子。然而，没有进一步的数据将核糖体功能与花粉发育联系起来。在这里，我们使用标准 A. thaliana 登录号 Col-0 表征了 RDP1 基因。由 CRISPR/Cas9 产生的移码突变体 rdp1-3 揭示了 RDP1 在开花中的多效性作用，从而表明该基因是花粉发育以外的多种过程所必需的。我们发现，天然的 Col-0 等位基因导致 Bor-4 等位基因的花粉数量减少，这是通过定量互补测试评估的，该测试比转基因实验更敏感。结合通过序列比对确定的 Col-0 中的历史重组事件，这些结果表明 RDP1 的编码序列是导致自然表型变异的候选区域。为了阐明 RDP1 参与的生物学过程，我们进行了转录组分析。我们发现负责核糖体大亚基组装/生物合成的基因在差异调控基因中富集，这支持了 rdp1-3 突变体中核糖体生物合成受到干扰的假设。在花粉发育基因中，编码碱性螺旋-环-螺旋 (bHLH) 转录因子的三个关键基因（ABORTED MICROSPORES ( AMS )、bHLH010 和 bHLH089 ）以及 AMS 的直接下游基因在 rdp1-3 突变体中下调。总之，我们的结果表明核糖体通过 RDP1 在花粉发育中发挥特殊功能，RDP1 含有受选择的天然变体。
用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域可生成具有替代靶向范围的紧凑型碱基编辑器
碱基编辑器是 RNA 引导的脱氨酶，可实现位点特异性核苷酸转换。这些 Cas 脱氨酶融合蛋白的靶向范围主要取决于靶基因座处原间隔区相邻基序 (PAM) 的可用性，并且仅限于 CRISPR-Cas R 环内的窗口，其中单链 DNA (ssDNA) 可供脱氨酶接触。在这里，我们推断 Cas9-HNH 核酸酶结构域在空间上限制了 ssDNA 的可及性，并证明省略该结构域会扩大编辑窗口。通过将 HNH 核酸酶结构域与单体或异二聚体腺苷脱氨酶交换，我们还设计了具有 PAM 近端移位编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器变体 (HNHx-ABE)。这项工作扩展了碱基编辑器的靶向范围，并提供了明显更小的碱基编辑器变体。此外，它还提供了 Cas9 蛋白质工程的未来潜在方向，其中 HNH 结构域可以被作用于 ssDNA 的其他酶取代。
改进的 gRNA 二级结构允许编辑抵抗 CRISPR-Cas9 切割的靶位
CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑的第一步是切割与 CRISPR 向导 RNA (gRNA) 中所谓的间隔序列互补的目标 DNA 序列。然而，一些 DNA 序列对 CRISPR-Cas9 切割具有抵抗性，这至少部分是由于 gRNA 折叠错误造成的。为了解决这个问题，我们设计了 gRNA，使其恒定部分具有高度稳定的发夹结构，并通过化学修饰进一步增强了它们的稳定性。“基因组编辑优化锁定设计”(GOLD)-gRNA 将基因组编辑效率提高了约 1000 倍（从 0.08% 到 80.5%），其他不同靶标的平均效率提高了 7.4 倍。我们预计，无论间隔序列组成如何，这种改进的 gRNA 都将实现高效编辑，并且在所需的基因组位点难以编辑时将特别有用。
Antonio D'Aloia Maria Chiara Errigo 编辑
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