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基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
引导编辑系统研究进展
flap 之间存在动态转换，使所需 DNA 信息有机会 与基因组的靶标链结合，之后 5' flap 会在细胞修复 的过程中被切除，经过 DNA 修复过程，最终实现基 因组信息的修改 ( 图 1 ) 。在这个过程中，融合蛋白 承担了切割目标位点非靶标链和逆转录的双重功 能，而 pegRNA 既引导 PE 识别目标位点，又包含了编辑 所需的信息。通过这 2 个组分， PE 系统实现了识 别、切割、起始逆转录的引物序列结合、逆转录等一 系列过程，并将所需 DNA 信息直接逆转录至目标 位点的断裂处 [ 26 ] 。 PE 系统的设计非常简单精巧，无 需引入 DNA 模板，也不产生双链断裂，是一种非常
新一代基因编辑工具研究进展
摘要 以核酸酶为主要成分的基因编辑工具目前已能对哺乳动物基因组实现可编程的定点突变或插入或删除。从锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas系统到更安全、更精准的Cas9融合蛋白基因编辑工具以及其他核酸酶基因编辑工具，本文系统地阐述了基因编辑的发展与演变，详细介绍了下一代基因编辑工具的开发与优化，并对基因编辑工具的临床应用与挑战进行了展望。 关键词 基因编辑；CRISPR/Cas9；碱基编辑；先导编辑；双链断裂；进展
基因组编辑技术及未来发展
[1] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. 混合限制性内切酶：锌指融合至 Fok I 切割域。美国国家科学院院刊，1996，93：1156-60 [2] Boch J, Scholze H, Schornack S 等人。破解 TAL 型 III 效应物的 DNA 结合特异性密码。科学，2009，326：1509-12 [3] Moscou MJ, Bogdanove AJ。一个简单的密码控制 TAL 效应物的 DNA 识别。科学，2009，326：1501 [4] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I 等人。适应性细菌免疫中的可编程双 RNA 引导 DNA 内切酶。 Science, 2012, 337:816-21 [5] Wyman C, Kanaar R. DNA双链断裂修复：结局好一切都好。Annu Rev Genet, 2006, 40:363-83 [6] Komor AC, Kim YB, Packer MS等人。无需双链DNA切割即可对基因组DNA中的目标碱基进行可编程编辑。Nature, 2016, 533:420-4 [7] Nishida K, Arazoe T, Yachie N等人。利用混合原核和脊椎动物适应性免疫系统进行靶向核苷酸编辑。Science, 2016, 353:8729 [8] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA等人。无需DNA切割即可对基因组DNA中的A*T进行可编程碱基编辑为G*C。 Nature, 2017, 551: 464-71 [9] Kurt IC, Zhou R, Iyer S, et al. CRISPR C-to-G 碱基编辑器用于诱导人类细胞中的靶向 DNA 颠换。Nat Biotechnol, 2021, 39: 41-6 [10] Zhao D, Li J, Li S, et al. 糖基化酶碱基编辑器可实现 C-to-A 和 C-to-G 碱基变化。Nat Biotechnol, 2021, 39: 35-40 [11] Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, et al. 搜索和
人原代T细胞基因组编辑
（ A ）使用ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 或 CD3 / CD28 / CD2 T 细胞激活活化剂人 T 2 - 3 天后，通过将 TCR αβ 和 CD3 受体与抗体结合，进行流式分析，来测定 TRAC 的敲除效率。每个条件的每个数据点代表一个单独的供体；n = 4 - 8 个供体。每一列线路表示干±标准差。（ B ） ）首先人T细胞被ImmunoCult™人CD3 / CD28 T细胞剂激活活化剂3天，然后进行电转。在电转48小时后，通过ArciTect™ T7循环内切酶I试剂盒测定基因组编辑（切割）的效率。 RNP 电转：+ RNP 。（ C - D ）被ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 T 细细胞激活剂活化 3 天的人 T 细胞经（ C ）模拟电转（无 RNP ）和（ D ） RNP 电转后 TCR αβ 和 CD3 的流式分析点图。（ E ）被ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 T 细胞激活剂活化 3 天的人 T细胞的CD4和CD8流式分析点图。
人类基因编辑国际法律治理研究
监管路径 国家或地区 相关法律法规 人类基因编辑监管特点 日本 2000 年《人类克隆技术管制法案》 (The Human 没有制定专门涉及人类胚胎、受精卵、精子 Cloning Regulation Act) ，禁止将克隆人胚胎和 或卵子的伦理指南和法律，其更多依赖于 具有人类和动物遗传物质的胚胎植入子宫。 各个政府部门的监督管理。 2013 年《再生医学安全保障法》 (Regeneration Medicine Promotion Law) ，分级管理再生医疗 风险，科研机构使用基因工程方法修饰后细 胞培养和处理需要通知日本卫生劳动福利部， 获得许可后方可开展研究。 保守 德国 1949 年《德国基本法》 (Basic Law for the Federal 《德国基本法》并没有提供明确和直接的规 Republic of Germany) ，其第 1 条和第 2 条分别规 定，但规定了立法机关必须保护胚胎的基 定了人的尊严、生命权和完整权，保护的范围 本权利。 不仅包括精神病患者、植物人，还包括胎儿和 《胚胎保护法》形成了完全禁止人类胚胎 胚胎。 基因编辑相关临床试验的逻辑森严的刑法 1990 年《胚胎保护法》 (The German Embryo 规制框架。 Protection Law) ，管理人工基因干预生殖系细 胞的情况，其第 5 条第 1 款规定任何人为改变人 类生殖系细胞遗传信息的人，将被处以最高 5 年的监禁或罚款；其第 5 条第 4 款专门规定了非 生殖目的的体外生殖系细胞人工干预不适用第 1 款刑事禁令，确保科研人员在安全性的前提 下进行人类胚胎相关实验的自由。 欧盟 2007 年《欧洲联盟基本权利宪章》 (Charter of 法律允许人类体细胞基因编辑，但明确禁止 Fundamental Rights of the European Union) ，其 在人类胚胎上使用基因编辑技术。 第 3 条禁止基因改造医疗行为，包括人种选择 行为、将人体作为经济收益来源的行为以及克 隆人类行为。 1997 年《人权与生物医学公约》 (Convention on Human Rights and Biomedicine) ，其第 13 条也引 入了对优生学的禁令，规定只能基于预防、诊 断或治疗目的修改人类基因组，并且不允许在 任何后代的基因组中引入任何基因改造。 折衷 美国 2015 年美国白宫发布了有关现阶段反对任何人类 法律不限制技术本身，但限制技术的应用场 种系基因组编辑行为的声明。 2015 年《综合拨 景。鉴于基因编辑是一种工具，不是特定 款法案》 (Consolidated Appropriations Act) ，增 的药物、设备或生物疗法，因而必须在其 加了禁止美国食品药品监督管理局 (Food and 使用的每个领域中审视其是否符合法律 Drug Administration) 使用任何联邦资金资助有 规定。 意修改人类胚胎可遗传物质的研究。 美国食品药品监督管理局禁止涉及可遗传 人类基因组编辑的临床试验，一些州也明 确禁止人类胚胎的特定研究活动。 中国 2020 年《民法典》第 1009 条，从事与人体基因、人 法律对人类体细胞基因编辑的研究和应用不 体胚胎等有关的医学和科研活动，应当遵守法 加以限制，人类胚胎细胞的基因编辑基础 律、行政法规和国家有关规定，不得危害 人体 研究不被禁止，但其临床应用则不被允 健康，不得违背伦理道德，不得损害公共利益。 许，不论是用于生殖目的或是医治患者。 2020 年《刑法》修正案 ( 十一 ) 增加第三百三十 六条，将基因编辑、克隆的人类胚胎植入人体 或者动物体内，或者将基因编辑、克隆的动物 胚胎植入人体内，情节严重的，处三年以下有 期徒刑或者拘役，并处罚金；情节特别严重的， 处三年以上七年以下有期徒刑，并处罚金。