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在突变小鼠品系中，基因通过跳过外显子重新启动转录和翻译，从而超越基因靶向策略

小鼠胚胎干细胞或受精卵中的基因破坏是鉴定体内基因功能的传统遗传学方法。然而，由于不同的基因破坏策略使用不同的机制来破坏基因，这些策略可能导致所得小鼠模型出现不同的表型。为了确定不同的基因破坏策略是否会影响所得突变小鼠的表型，我们对通过三种常用策略（确定性敲除 (KO) 优先和 CRISPR/Cas9）产生的 Rhbdf1 小鼠突变株进行了表征。我们发现 Rhbdf1 对不同的 KO 策略的反应不同，例如，通过跳过外显子并重新启动翻译来潜在地产生获得功能的等位基因，而不是预期的无效或严重的次等位基因。我们的分析还显示，使用 KO 优先策略产生的小鼠中至少有 4% 表现出相互冲突的表型，这表明外显子跳过是整个基因组中普遍存在的现象。此外，我们的研究强调，至少 35% 的小鼠和 45% 的人类蛋白质编码基因可能易于发生靶向 KO 优先和 CRISPR/Cas9 介导的意外翻译。我们的研究结果对基因组编辑在基础研究和临床实践中的应用具有重要意义。简介小鼠在基因上与人类密切相关，因此选择小鼠作为模型系统来破译约 20,000 个蛋白质编码基因的功能，以深入了解人类生物学和疾病。对于大规模小鼠诱变工作，通过小鼠胚胎干 (ES) 细胞中的同源重组进行基因靶向是一种有效且通用的技术。基因靶向涉及确定性无效设计（删除目标基因的整个基因组序列）或靶向敲除 (KO) 优先设计，这提供了多种优势，包括基因破坏和报告标记突变，此外，还允许以组织特异性或时间方式分析基因功能。最近，使用 CRISPR/Cas9 直接破坏受精卵中的基因已经取代了确定性无效和 KO-first 策略。为了确定不同的基因靶向策略是否会影响纯合突变小鼠的表型，我们系统地表征了由这三种 KO 策略（确定性无效、靶向 KO-first 和 CRISPR/Cas9）产生的 Rhbdf1 突变小鼠。Rhbdf1 基因编码 RHBDF1，并被认为在生长发育 [1]、炎症 [2] 和癌症 [3-5] 中起关键作用。确定性无效和靶向 KO-first 策略是强大的高通量方法，可用于 ES 细胞中的大规模基因靶向，以研究数千种哺乳动物蛋白质编码基因，从而更好地了解人类生物学和疾病 [6-8]。在使用确定性无效策略时，基于细菌人工染色体 (BAC) 的打靶载体替换靶基因的整个基因组序列 (补充图 1a)，从而产生无效等位基因。相比之下，靶向 KO-first 方法 [9, 10] 是一种包括可根据所需结果选择的替代步骤的策略，具有高度的通用性，