XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System胞嘧啶
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
利用胞嘧啶碱基编辑进行 CRISPR-Cas 引导的福氏志贺氏菌染色体和毒力质粒诱变
摘要 志贺氏菌是一种革兰氏阴性细菌，可侵入人体肠道上皮。由此引起的感染志贺氏菌病是最致命的细菌性腹泻病。有关决定志贺氏菌病理生理的基因（包括染色体和毒力质粒）的大部分信息都是通过经典反向遗传学获得的。然而，流行的诱变技术的技术限制使得单次反应中只能产生少量突变体，从而阻碍了大规模的志贺氏菌靶向诱变和随后的表型评估。我们采用了一种 CRISPR-Cas 依赖性方法，其中切口酶 Cas9 和胞苷脱氨酶融合在单向导 RNA（sgRNA）的引导下引入靶向 C ！ T 转换，导致内部终止密码子和翻译过早终止。在使用 mCherry 荧光报告基因的原理验证实验中，我们能够在大肠杆菌和志贺氏菌中生成功能丧失突变体，效率高达 100%。使用改进的波动分析，我们确定在优化条件下，由 Cas9 脱氨酶融合引入的非靶向突变的频率与自发突变在同一范围内，这使我们的方法成为细菌诱变的安全选择。此外，我们对该方法进行了编程，以突变已充分表征的染色体和质粒携带的志贺氏菌基因，并发现突变体的表型与已报道的基因缺失突变体的表型相似，在表型水平上没有明显的极性效应。该方法可用于 96 孔板格式，以提高通量并在几天内生成一系列靶向功能丧失突变体。
5-羟基甲环胞嘧啶在无血浆细胞DNA中的测序鉴定了前列腺癌患者的独特表观基因组特征
结果和局限性：5hmc-sequesting的平均每样本读数为18.6（6.03至4243）的读数为98％（95-99％）可映射率。基线样本比较确定了20例进展患者和35例没有进展的患者的23,433个基因中的1,642个显着的5HMC差异（错误发现率，FDR <0.1）。进展的患者在多个标志性基因集中表现出明显的富集，并作为雄激素反应作为最大的富集基因集（FDR = 1.19E-13）。有趣的是，这种富集是由疾病进展的一组亚组驱动的，其基因组的5HMC高甲基化涉及AR，FOXA1和GRHL2。为了量化这些基因集的整体活性，我们使用整个基因集中基因读数的log2比率的平均值开发了一种基因集活性评分算法。我们发现，这些基因组中的活性得分在该亚组中的进展患者中明显高于其余患者，而不论进展状态如何。此外，这些基因集中的高活性评分与无进展的生存率差有关（p <0.05）。纵向分析表明，在3个月ADT后，该亚组中的活动得分显着降低，但在疾病进展后恢复了高水平。
accubasetm胞质基础编辑
Accubase™是由基本治疗剂设计的，由Kactus为全球销售制造而设计的胞嘧啶基本编辑器。它创造性地将脱氨酶嵌入了CAS蛋白中，以防止脱氨酶与非目标位点的随机结合，从而显着降低了靶向的发生，同时仍保持较高的编辑效率。使用我们的蛋白质工程和表达平台，结构辅助多路复用筛选（SAMS™），Kactus成功地制造了DNA基础编辑器。我们通过筛选Accubase™蛋白表达系统，优化纯化过程并执行配方开发来最大程度地提高Accubase™的稳定性，纯度和活性。Accubase™是一种可将C•G碱基对转换为t•碱基对的胞嘧啶碱基编辑器。
使用新型杂化胸腺胺DNA糖基化酶
胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的水解脱氨基驱动许多在人类癌症中观察到的过渡突变。脱氨基诱导的诱变中间体包括尿嘧啶或胸腺素加合物误导了鸟嘌呤。虽然存在多种方法来测量其他类型的DNA加合物，但胞质脱氨基加合物却带来了异常的分析问题，并且尚未开发出足够的测量方法。我们在这里描述了一种新型的杂化胸腺素DNA糖基化酶（TDG），该糖基化酶（TDG）由与胸腺糖基化酶在古细菌中发现的29个氨基酸序列组成，该序列是与胸腺素糖基化酶的催化结构域相关的29-氨基酸序列。使用定义的序列寡核苷酸，我们表明杂交TDG具有强大的失误选择性活动，以对脱氨酸u：g和t：g mistairs。我们进一步开发了一种将糖基酶释放的游离碱与oli-Gonucleotides和DNA分离的方法，然后是GC - MS/MS定量。使用这种方法，我们在第一次测量了尿嘧啶，u：g和t：g对的水平。此处介绍的方法将允许测量一类具有生物学上重要的脱氨酸胞嘧啶加合物类别的结构，持久性和修复。
epiGBS 与 WGBS 结果比较
DNA 胞嘧啶甲基化是一种表观遗传机制，参与调节植物对生物和非生物胁迫的反应，其改变能力随胞嘧啶出现的序列环境（CpG、CHG、CHH，其中 H = 腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶）而变化。模型植物物种中的 DNA 甲基化定量通常通过全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）进行，这需要高质量的参考基因组。精简代表性亚硫酸盐测序 (RRBS) 是一种经济有效的潜在替代方案，适用于基因组资源有限且实验设计规模大的生态研究。在本研究中，我们首次全面比较了 RRBS 和 WGBS 的输出，以表征 DNA 甲基化对给定环境因素的反应变化。具体而言，我们使用 epiGBS（最近优化的 RRBS）和 WGBS 来评估 Populus nigra cv. 无性系中昆虫和人工食草后的整体和序列特异性差异甲基化。 'italica'。我们发现，在两种食草处理中的任何一种之后，CHH 中的全局甲基化百分比都会增加，并且只有 epiGBS 检测到这种转变具有统计学意义。至于食草引起的位点特异性差异甲基化（epiGBS 中的胞嘧啶和 WGBS 中的区域），两种技术都表明昆虫和人工食草引起的反应具有特异性，并且 CpG 中的低甲基化和 CHH 中的高甲基化频率更高。当存在于 CpG 和 CHG 中时，甲基化变化主要发现在基因体和基因间区域，而在 CHH 环境中则发现在转座因子和基因间区域。因此，epiGBS 成功地表征了伦巴第杨对食草反应的全局全基因组甲基化变化。我们的研究结果支持 epiGBS 在旨在探索非模型植物物种对多种环境因素反应的表观遗传变化的大型实验设计中特别有用。
活性 DNA 去甲基化位于杆状病毒的上游...
多能视网膜祖细胞的视网膜细胞命运决定受染色质结构和基因表达的动态变化控制。DNA 胞嘧啶甲基化 (5mC) 受到积极调控，以正确控制基因表达和染色质结构。许多基因在视网膜发育过程中表现出活性 DNA 去甲基化；这个过程需要将 5mC 氧化为 5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC)，并由十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶 (TET) 酶控制。使用一系列等位基因条件性 TET 酶突变体，我们确定 DNA 去甲基化是 NRL 和 NR2E3 表达上游所必需的，以建立视杆细胞命运。使用组织学、行为学、转录组学和碱基对分辨率 DNA 甲基化分析，我们确定抑制活性 DNA 去甲基化会导致整体变化