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World File Search System脱氨
C 到 U RNA 脱氨是加速 SARS-CoV-2 进化的驱动力
了解SARS-CoV-2猖獗突变的分子机制将有助于我们控制COVID-19大流行。APOBEC介导的C-to-U脱氨是SARS-CoV-2基因组中的主要突变类型。然而，尚不清楚C-to-U的新型突变率u是否高于其他突变类型，以及详细的驱动力是什么。通过分析SARS-CoV-2全球人口数据的时间过程，我们发现C-to-U在所有突变类型中具有最高的新型突变率u，并且该u仍在随时间增加（du / dt> 0）。与其他突变类型相比，新型C-to-U事件对特定的基因组区域具有偏好。局部性较差的RNA结构与较高的新型C-to-U突变率相关。级联模型很好地解释了C-to-U脱氨的du / dt> 0。在SARS-CoV-2中，RNA结构是C到U脱氨速率极高且持续加速的分子基础。该机制是SARS-CoV-2突变、适应和进化的驱动力。我们的发现有助于我们理解病毒突变率的动态演变。
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
FFPE DNA 显示出两种主要错误特征，它们源自胞嘧啶和甲基胞嘧啶的脱氨作用，可以使用不同的修复策略来缓解
摘要避免由损伤引起的测序错误是准确识别 DNA 样本中中到稀有频率突变的关键步骤。在 FFPE 样本中，胞嘧啶部分的脱氨作用代表了导致 DNA 材料丢失和测序错误的重大损伤。在这项研究中，我们证明，虽然胞嘧啶和甲基化胞嘧啶部分的脱氨作用造成的损伤会导致 C 到 T 的转换升高，但错误概况和调解策略是不同的并且容易区分。虽然胞嘧啶脱氨引起的损伤诱导测序错误是由 NGS 工作流程中常用的末端修复步骤驱动的，但甲基化胞嘧啶脱氨引起的 DNA 损伤是 CpG 位点测序错误的另一个主要因素。尿嘧啶 DNA 糖基化酶和人胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶可以分别消除和减轻 FFPE DNA 样本中的两种损伤，从而显著提高中等等位基因频率变异鉴定的测序准确性。
使用 Cas9 - 腺嘌呤脱氨酶融合在细菌中进行可编程腺嘌呤脱氨†
系统已被探索作为有效的选择剂来消除未编辑的细胞，从而大大简化了细菌中的基因操作过程。9尽管基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑方法简单且高效，但它们仍然依赖于细菌中的 HR 来实现精确的基因操作，因此难以在某些缺乏强大 HR 系统的细菌（如结核分枝杆菌）中建立。最近，脱氨酶介导的碱基编辑系统的发展为生物学中的精确基因操作提供了新策略。10 – 12碱基编辑系统使用脱氨反应和随后的 DNA 复制过程直接转换目标碱基，而不是前面提到的基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑方法中所利用的 HR。已经建立了两种主要类型的碱基编辑系统：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）10,11 和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。 12,13 CBE 已广泛用于各种生物体（包括真核生物 10,11,14 - 17 和一些细菌物种 17 - 22）中的可编程胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化，而 ABE 主要在真核生物中建立，例如哺乳动物细胞 12,23 和植物 24,25，用于精确的腺嘌呤到鸟嘌呤的转化。最近，在链霉菌中开发了一种名为 CRISPR-aBEST 的 ABE 系统。13 此外，还开发了可编程的腺苷到肌苷和胞苷到尿苷的 RNA 编辑器。26,27
SARS-CoV-2 基因组中的短序列基序动态表明胞嘧啶脱氨在 CpG 减少中起着作用
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2021 年 1 月 5 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.06.19.161687 doi：bioRxiv 预印本
ADAT：在 tRNA 编辑中的作用及其与疾病的相关性
摘要 转移 RNA (tRNA) 在蛋白质生物合成中起着核心作用。转录后 RNA 修饰影响 tRNA 的功能和稳定性。在这些修饰中，RNA 编辑是生命三个领域中广泛存在的 RNA 修饰。作用于 tRNA 的腺苷脱氨酶 (ADAT) 家族的蛋白质是在 20 多年前发现的。它们在 tRNA 成熟过程中催化腺苷脱氨为肌苷 (A - 到 - I) 或胞苷脱氨为尿苷 (C - 到 - U)。研究最多的例子是原核或真核 tRNA 反密码子中 tRNA 摆动位置的 TadA 或 ADAT2 / 3 介导的 A - 到 - I 转换。本综述提供了有关不同生命领域中 tRNA 的 A 到 I 和 C 到 U 编辑的详细信息，介绍了有关 DNA 编辑的 ADAT 的最新发现，最后评论了 ADAT3 基因突变与智力障碍之间的关联。
5mC 选择性脱氨酶的发现及其在碱基分辨率甲基化位点超灵敏直接测序中的应用
摘要 挖掘噬菌体中的新酶活性对于开发新的生物技术工具仍然很重要。在本研究中，我们使用 MetaGPA（一种将宏基因组数据中的基因型与表型联系起来的方法）来识别脱氧胞苷脱氨酶，这是一种与宏病毒组中的胞嘧啶修饰高度相关的蛋白质家族。出乎意料的是，这些脱氨酶的一个子集在单核苷酸和单链 DNA 底物中都表现出对 5-甲基胞嘧啶 (5mC) 的偏好，而不是胞嘧啶 (C)。在甲基化组测序工作流程中，这些酶优先脱氨 5mC，这使得甲基化胞嘧啶能够直接转化，同时完全消除任何未修饰胞嘧啶的背景脱氨。这种直接转换允许以单碱基分辨率精确识别甲基化位点，具有无与伦比的灵敏度，为基因组和甲基化组的同时测序提供了广泛的应用。
中尺度 DNA 特征影响 APOBEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性并塑造肿瘤突变景观
抗病毒 DNA 胞嘧啶脱氨酶 APOBEC3A 和 APOBEC3B 是癌症突变的主要来源，它们催化胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。APOBEC3A 优先靶向单链 DNA，对采用茎环二级结构的 DNA 区域具有明显的亲和力。然而，APOBEC3A 和 APOBEC3B 的详细底物偏好尚未完全确定，DNA 序列对 APO-BEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性的具体影响仍有待研究。在这里，我们发现 APOBEC3B 也选择性地靶向 DNA 茎环结构，它们与 APOBEC3A 脱氨的结构不同。我们开发了 Oligo-seq，这是一种基于体外测序的方法，用于识别促进 APOBEC3A 和 APOBEC3B 活性的特定序列环境。通过这种方法，我们证明了 APOBEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性受到目标胞嘧啶周围特定序列的强烈调控。此外，我们还确定了 APOBEC3B 和 APOBEC3A 的结构特征，这些特征决定了它们的底物偏好。重要的是，我们确定了肿瘤基因组内发夹形成序列中 APOBEC3B 诱导的突变与 APOBEC3A 突变的 DNA 茎环序列不同。总之，我们的研究提供了证据，表明 APOBEC3A 和 APOBEC3B 可以在癌症基因组中产生不同的突变景观，这是由它们独特的底物选择性驱动的。
Cas13介导的RNA修饰的可编程系统及其生物和生物医学应用
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas13 引起了广泛关注，通常用于在 RNA 水平上控制基因表达和细胞命运。除了由其核酸内切酶活性介导的 RNA 干扰外，核酸酶失活形式的 Cas13 还提供了一个多功能的 RNA 引导的 RNA 靶向平台，用于在转录后操纵各种 RNA 修饰。化学修饰调节 RNA 命运的各个方面，包括翻译效率、可变剪接、RNA-蛋白质亲和力、RNA-RNA 相互作用、RNA 稳定性和 RNA 易位，最终协调细胞生物活动。本综述总结了 CRISPR-Cas13 系统的历史、RNA 修饰的基本组成部分以及相关的生理和病理功能。我们专注于开发基于催化失活 Cas13 的表观转录编辑工具包，包括用于腺苷脱氨的可编程 A 到 I 替换 (REPAIR) 和 xABE（腺苷碱基编辑器）、用于胞苷脱氨和 dm 6 ACRISPR 的特异性 C 到 U 交换 (RESCUE) 和 xCBE（胞苷碱基编辑器），以及使用 CRISPR-dCas13 (PAMEC) 进行 m 6 A 编辑的靶向 RNA 甲基化 (TRM) 和光激活 RNA m 6 A 编辑系统。我们进一步重点介绍了这些有用的工具包在细胞生物学、疾病和成像中的新兴应用。最后，我们讨论了潜在的局限性，例如脱靶编辑、低编辑效率和 AAV 传递的限制，并提供了可能的优化策略。
