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World File Search System脱靶
CRISPR/Cas9 gRNA 载体
• 并行使用至少两个独立的 gRNA 序列来获得不同的克隆。通过基因组编辑创建的模型使用不同的 gRNA，这些 gRNA 共享靶位点，但不共享脱靶位点，是创建独立重复的绝佳方法。 • 为每个使用的 gRNA 分离多个独立的克隆细胞群。在独立克隆中，脱靶 DSB 发生在相同位点的可能性非常低。 • 虽然很少有实验室有资源进行统计上强大的全基因组测序验证协议（例如 gUIDEseq），但相对容易地为每个您使用的 gRNA 选择几个预测的脱靶序列，然后围绕这些位点进行测序，以确保没有引入脱靶插入/缺失。
种群规模的细胞指南seq-2和生化变化seq-r轮廓揭示了人遗传变异经常影响cas9脱靶活动
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2025年2月12日发布。 https://doi.org/10.1101/2025.02.10.637517 doi：Biorxiv Preprint
解决siRNA药物治疗遗传病的副作用问题
“脱靶效应很可能发生在存在与 siRNA 种子区域形成碱基配对的非靶标 mRNA 时，”Hiroshi Abe 教授解释道。“我们意识到，可以通过化学修饰降低该种子区域的碱基配对能力或双链稳定性来抑制脱靶效应，确保只有当整个引导链与靶标 mRNA 结合时才能形成稳定的复合物。”
靶向抑制邻近基因的翻译
摘要基于靶向选择的基因组编辑方法已实现许多基础发现，并且通常以高精度使用。然而，我们发现，在芽殖酵母中用常见的选择盒替换 DBP1 会导致相邻基因 MRP51 的表达和功能降低，尽管所有 MRP51 编码和调控序列都保持完整。盒式诱导的 MRP51 抑制导致了在删除 DBP1 的细胞中检测到的所有突变表型。这种行为类似于“邻近基因效应”（NGE），这是一种机制未知的现象，即在一个基因座插入盒式会降低邻近基因的表达。在这里，我们利用 DBP1 盒式替换导致的强烈脱靶突变表型来提供对 NGE 的机制洞察。我们发现启动子（包括表达盒中的启动子）固有的双向性会驱动发散转录本，该转录本通过转录干扰和翻译抑制来抑制 MRP51，而这种抑制是通过产生长未解码转录本异构体 (LUTI) 介导的。驱动这种脱靶效应的发散转录本产生对于酵母表达盒来说是普遍存在的，并且随插入而普遍发生。尽管如此，脱靶效应通常可以通过局部序列特征自然阻止，例如终止盒插入位点和邻近基因之间的发散转录本的序列特征。因此，可以通过将转录终止子序列插入盒中（位于启动子两侧）来消除盒诱导的脱靶效应。由于这种脱靶效应的驱动特征被广泛保留，我们的研究表明，在使用集成表达盒的其他真核系统（包括人类细胞）中的实验设计和解释时应考虑到这一点。
2024年4月22日，星期一15:00-16:20虚拟活动
ID 66 Christian Anthon Cop大学... 单个细胞中CRISPR脱靶的评估揭示了先前未鉴定的离子靶标，并提供了与细胞染色质和基因表达状态有关的机械见解ID 66 Christian Anthon Cop大学...单个细胞中CRISPR脱靶的评估揭示了先前未鉴定的离子靶标，并提供了与细胞染色质和基因表达状态有关的机械见解
改造 Cas12a 核酸酶变体，增强基因组编辑特异性
AU：请确认所有标题级别均正确显示：成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas12a 系统是基因编辑的强大工具；然而，crRNA-DNA 错配可能会引起不必要的切割事件，尤其是在 PAM 的远端。为了最大限度地减少这种限制，我们通过修改与靶 DNA 和 crRNA 链相互作用的氨基酸残基，设计了一种携带突变 S186A/R301A/T315A/Q1014A/K414A 的超保真 AsCas12a 变体（称为 HyperFi-As）。HyperFi-As 保留了与人类细胞中的野生型 AsCas12a (AsCas12aWT) 相当的靶向活性。我们证明 HyperFi-As 显著降低了人类细胞中的脱靶效应，并且与野生型相比，HyperFi-As 对 PAM 远端区域位置的错配容忍度明显较低。此外，采用改进的适当恒定力单分子 DNA 解拉链分析来评估 CRISPR/Cas 核糖核蛋白 (RNP) 复合物的稳定性和瞬态阶段。在 DNA-Cas12a-crRNA 复合物的解体过程中敏感地检测到了多种状态。在脱靶 DNA 底物上，与 AsCas12aWT 相比，HyperFi-As-crRNA 更难维持 R 环复合物状态，这可以准确解释为什么 HyperFi-As 在人类细胞中具有较低的脱靶效应。我们的研究结果提供了一种具有低脱靶效应的新型 AsCas12a 变体，尤其能够处理 PAM 远端区域的高脱靶。在单分子水平上，我们还揭示了 AsCas12a 变体在脱靶位点的行为方式，而用于评估 CRISPR/Cas RNP 复合物多种状态的解压缩分析可能对深入了解 CRISPR/Cas 的行为方式以及将来如何对其进行工程改造大有帮助。
SAFER-Detection 用于有效检测基因编辑人类细胞中的 DNA 重排
评估人类基因组编辑产品安全性的一个重要标准是验证基因组完整性。这包括对大量插入或缺失、外源 DNA 整合以及致癌性或插入诱变可能性的评估。在本研究中，我们介绍了 SAFER-Detection（高效重排检测的选择性扩增）。SAFER-Detection 是一种基于标记和下一代测序的方法，旨在以单碱基分辨率定量检测染色体重排断点。该方法能够对由可编程核酸酶（如 CRISPR/Cas 和 TALEN）进行的靶向和脱靶编辑导致的重排进行分类。SAFER-Detection 使用 Cas9 和 CCR5 向导 RNA，可轻松识别靶位点 (CCR5) 与附近同源物 (CCR2) 中的脱靶或同源位点之间的染色体内缺失、插入和倒位。CCR5 靶位点与 chr1 和 chr13 上的脱靶位点之间的染色体间易位也被捕获并通过 PCR 进一步验证。SAFER-Detection 在检测由脱靶活动或同源重组介导的染色体内和染色体间重排方面表现出高灵敏度，适用于含有低细胞数的样本。当与灵敏的脱靶提名技术（如 ONE-seq）结合使用时，SAFER 检测提供了一种评估治疗性基因组编辑中染色体重排风险的宝贵方法。
GFP转基因恒河猴的克隆和碱基编辑...
我们报告了通过体细胞核移植 (SCNT) 和胚胎碱基编辑克隆了一只 12 岁的转基因绿色荧光蛋白 (GFP) 猴，同时对腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 进行了安全性评估。我们首先展示了 ABEmax 通过在 293T 细胞中对 GFP 序列进行 A 到 G 编辑来沉默 GFP 的能力。随后，使用表达 GFP 的猴子的供体细胞，我们成功生成了 207 个 ABEmax 编辑 (SCNT-ABE) 和 87 个野生型 (SCNT) 胚胎，用于胚胎移植、基因分型以及基因组和转录组分析。使用一种名为 OA-SCNT 的新方法，对 SCNT-ABE 和 SCNT 胚胎进行比较以进行脱靶分析，而无需遗传变异的干扰。在编辑的猴胚胎中，ABEmax 不会诱导明显的脱靶 DNA 突变，但会诱导广泛的脱靶 RNA 突变，其中 35% 是外显子。研究结果为ABE的临床应用提供了重要参考。
HBG启动子的基础编辑可诱导有效的胎儿血红蛋白表达，而在人HSC中无可检测到的脱靶突变
？），ying.zhang84@whu.edu.cn（y.z。）https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.10.007https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.10.007