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茄科作物病毒诱导基因组编辑方法的开发
使用 CRISPR/Cas 系统的基因组编辑 (GE) 彻底改变了植物诱变。然而，传统的转基因介导的 GE 方法存在局限性，因为通过组织培养生成表达 Cas9/单向导 RNA (sgRNA) 模块的稳定转基因系需要花费很长时间。病毒诱导的基因组编辑 (VIGE) 系统已成功用于模型植物，例如拟南芥和烟草属。在本研究中，我们开发了两种用于茄科植物的 VIGE 方法。首先，我们使用烟草脆裂病毒 (TRV) 载体将 sgRNA 递送到表达 Cas9 的转基因番茄 (Solanum lycopersicum) 品种 Micro-Tom 品系中。其次，我们设计了一种基于马铃薯病毒 X (PVX) 载体的非转基因 GE 方法来递送 Cas9 和 sgRNA。我们设计并克隆了靶向八氢番茄红素去饱和酶的 sgRNA，并将其放入 VIGE 载体中，并确定了 VIGE 的最佳条件。我们通过病毒载体接种后对靶基因的深度测序来评估 VIGE 效率，检测到 TRV 和 PVX 介导的 GE 的突变率分别为 40.3% 和 36.5%。为了提高编辑效率，我们采用了 37 ◦ C 热处理，这分别使 TRV 和 PVX 介导的 VIGE 的编辑效率提高了 33% 至 46% 和 56% 至 76%。为了获得编辑植物，我们对接种的子叶进行了组织培养，获得了成功的编辑事件。我们还证明 PVX 介导的 GE 可应用于其他茄科作物，例如马铃薯 (Solanum tuberosum) 和茄子 (Solanum melongena)。这些简单且高效的 VIGE 方法在茄科作物中生成基因组编辑植物方面具有巨大潜力。
通讯 使用 SpCas9-NG 变体扩展 P. patens 中的 CRISPR 工具箱以及在茄科作物中基因和碱基编辑的应用
摘要：基因组编辑已成为多种物种功能研究和植物育种的主要工具。除了通过经典的 CRISPR-Cas9 系统产生敲除外，CRISPR 碱基编辑的最新发展为产生获得功能突变体提供了巨大而令人兴奋的机会。PAM 要求是 CRISPR 技术（如碱基编辑）的一大限制，因为碱基替换主要发生在较小的编辑窗口中。由于精确的单个氨基酸替换可能导致与某些域或农艺性状相关的功能，因此开发具有宽松 PAM 识别的 Cas9 变体对于基因功能分析和植物育种至关重要。最近，识别 NGN PAM 的 SpCas9-NG 变体已在植物中成功测试，主要是在单子叶植物中。在这项研究中，我们研究了 SpCas9-NG 在模式苔藓 Physcomitrella patens 和两种茄科作物（番茄和马铃薯）中对经典 CRISPR 基因敲除和胞嘧啶碱基编辑的效率。我们发现 SpCas9-NG 允许靶向非典型 NGT 和 NGA PAM，大大扩展了基因组编辑的范围。我们在研究中开发的 CRISPR 工具箱为模式植物和作物开辟了新的基因功能分析和植物育种前景。