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干细胞研究
转基因株系采用第二代 CRISPRa 系统，该系统携带与异源三聚体 VPR 反式激活因子融合的核酸酶缺陷型 dCas9，该异源三聚体 VPR 反式激活因子由 VP64、p65 和 RTA 结构域组成。该系统可用于解释任何所需细胞类型的内源性调控机制。使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法，我们以 AAVS1 人类基因组位点为目标，分别引入先前描述的 dCas9VPR-tdTomato（Schoger 等人，2020 年）和嘌呤霉素盒，这些盒受 CAG 和 EF1a 启动子的控制（图 1 A）。采用优化的核转染方案转染 LhiPSC-GR1.1 细胞。转染后，选择具有 tdTomato 表达的细胞并通过 PCR 进行基因分型（图 1B，引物结合如图 1A 所示，黑色引物仅扩增野生型 (WT) 片段；绿色引物扩增插入的构建体）。随后，扩增、分析和冷冻保存两个阳性克隆（#2 和 #3）。DNA 测序数据证实了 AAVS1 基因座中的正确和纯合敲入转基因整合（图 1C，显示为克隆#2）。PCR 结果显示，在筛选的 15 个克隆中，11 个克隆含有纯合插入（命名为 CRISPRa 细胞），1 个克隆是杂合的，3 个克隆不含有插入而是含有 WT 完整基因座（用作对照细胞）（数据未显示）。通过分析 PCR 和测序预测的前五个脱靶位点进行脱靶分析；在这些位点中均未发现任何编辑事件。对照电穿孔和非电穿孔 (参考) 系用于比较 (补充图 1A)。所有系的支原体检测均为阴性。通过基于 SNP 的核型分析和标准 G 带证明了 CRISPRa 克隆 #2 和 #3 以及对照细胞的基因组完整性。未检测到数值或结构异常的证据 (图 1D)。与核转染 (图 1Ei) 和非核转染对照相比，细胞生长和形态正常。与对照 hiPSC 相比，CRISPRa 中的 dCas9 和 tdTomato 表达证实了转基因表达，如 Western blot (补充图 1B，显示克隆 #2 和 #3) 和共聚焦显微镜 (图 1Eii，显示克隆 #2，n = 3 个不同传代) 所示。通过免疫荧光分析干性标记 OCT4 的表达（图 1 Eiii）和流式细胞术分析（显示 94.2% OCT4 和 99.9% TRA1-60 阳性细胞（图 1 Eiv）（显示克隆 #2））来评估多能性。通过在 CRISPRa 和对照系中形成胚状体 (EB) 和定向分化来测试向所有三个胚层的自发分化能力。免疫荧光分析证实了 AFP、β-III-Tu bulin 和 α-平滑肌肌动蛋白 (ACTA2) 的表达，进一步支持内胚层、外胚层和中胚层的命运（图 1 F，显示克隆 #2 和 #3）。转录水平分析表明配对盒 3 ( PAX3 ) 和微管相关蛋白 2 ( MAP2 ) 的表达表明外胚层分化；T-box 转录因子 T ( TBXT ) 表明中胚层命运，而 α-Feto-Protein ( AFP ) 表明内胚层分化（补充图 1 C，显示克隆 #2 和 #3）。我们研究了 CRISPRa 系用于研究通过定向 2D 分化产生的心肌细胞的适用性，这种分化产生了自发跳动的细胞（视频作为补充材料提供），具有强大的 α-辅肌动蛋白 2 (ACTN2) 和心脏肌钙蛋白 T (TNNT2) 心脏标志物表达（（补充图 1D，显示为克隆#2）。最后，我们通过确定与心脏肥大和代谢稳态有关的 KLF15 表达的诱导来测试 CRISPRa 系的功能。我们发现，与转染了非靶向 gRNA 的各自亲本系相比，设计用于结合 KLF15 转录起始位点 (TSS) 的 44 bp 5'-上游序列的单个指导 RNA 能够显着增强 CRISPRa 系（克隆#2 和#3）中 KLF15 的转录。对照细胞没有显示独立于转染的 gRNA 的活化（图 1G）。总之，使用完全表征的 hiPSC 系，我们生成了具有纯合靶向插入、正常核型和多能性的人类 CRISPRa 系，并显示出其激活
研究和评估一种新的基质血管分数收获技术：皮下组织来源收获一项step™技术
基质血管分数（SVF）使用常规吸脂技术收集是一种创伤技术，可增加再生成分的细胞凋亡，需要使用酶和细胞培养。该研究描述和评估，使用创新的单步刺激技术获得的总基质血管分数（SVF）细胞的数量和生存能力的有效性，一种STEP™技术，分类为微小级别的脂肪脂肪脂肪脂肪脂肪脂肪脂肪含量收集。手术室中的便携式电池计数器设备（Luna STEM™）用于通过荧光分析样品。总细胞，成核，无核和生存力。对八名接受脂肪灌木的健康患者进行了研究，从2020年1月至2021年12月之间，每位患者（n = 16）收集了两个样品（n = 16）。选择了periumbilical区域。作为供体面积和腹部壁分配为perium骨面积，并将腹部壁分为右侧和左侧。红外光发射后，在封闭的系统（注射器）中收集了每侧40 cc的脂肪组织。简单的离心，在吸入脂肪组织后没有操纵或使用的酶，才能获得10 CC的基质血管分数。一步™技术允许收集脂肪组织，该脂肪组织保留了含有所有再生基质元素作为细胞外基质而无需处理或操纵的细胞外基质；使用简单的离心方案和非酶消化过程需要20分钟，以保留样品的基质元素。根据表格和直方图，获得的细胞总数为1.06×10 7 /ml和2.11×10 7 /ml，具有92.5％的生存能力和0-5个死亡细胞。具有选择性光刺激特性的一个步骤™技术，可以从结构结缔组织（胶原蛋白纤维）中释放脂肪细胞和基质血管分数。获得大量的基质血管分数细胞，具有高活性，可用于潜在的再生治疗。这种创新技术（光刺激）可以改变概念并改善基质血管分数收获，遵循“最小级别的操纵”过程的参数。
phyllanthus emblica l的提取物的抗糖尿病和免疫调节活性。在自发性和环磷酰胺加速糖尿病小鼠的点头。
摘要：油器，也称为emblica，是phyllanthus emblica l属的果实。果实富含营养素，并显示出优秀的医疗保健功能和发育价值。这项研究的主要目的是研究乙酸乙酸酯提取物的活性，来自Phyllanthus Emblica L.（EPE）对1型糖尿病（T1D）（T1D）和免疫调节活性在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠中使用自发性和环磷有磷酸（CYP） - 酸糖蛋白酶的活性。epe分别以400 mg/kg体重的剂量分别为15或4周，每天以400 mg/kg体重的剂量，每天以15或4周的剂量给予自发点头点头（S-NOD）小鼠（S-NOD）小鼠（CYP-NOD）小鼠。最后，收集了血样进行生物学分析，解剖器官组织以进行组织学和免疫荧光分析（IF）染色（包括BCL和BAX的表达），通过Western Blotting和Forkhead Box P3（Foxp3）和Helper T Lymphocyte 1（Treg treg threg celleg threg th1（Th1）/Th1（Th2）/Th1（Th2）/Th1（Th2）/Th2（Th2）/Th2（Th2）/Th1（Th2）/Th1（Th2）/Th1（Th2）/Th2（Th2）/TH1（Th2）/TH1（TH2）/TH1（TH2）/TH1（TH2）/TH1（TH2）。细胞分布通过流量细胞仪。我们的结果表明，经过EPE治疗的NOD小鼠或CYP加速NOD小鼠的血糖水平和HBA1C水平降低，但血液胰岛素水平的增加。EPE治疗降低了Th1细胞的IFN-γ和肿瘤坏死α（TNF-α）的血液水平，而Th17细胞降低了白介素（IL）-1β和IL-6的血液，但IL-4，IL-10的血液水平降低了IL-4，IL-10，而IL-4，IL-10，并通过Th2细胞在TH2中增加了IL-4，IL-10，并通过Th2细胞的模型增加。免疫吸附测定（ELISA）分析。EPE处理的小鼠显示胰岛内胰岛素的平均免疫反应系统（IRS）得分有所增加，并且胰岛数量的增强。流式细胞仪数据表明，经EPE处理的CYP-NOD小鼠降低了CD4 + IL-17和CD4 + Intferon Gamma（IFN-γ）的CD4 +子集T细胞分布（IFN-γ），但增加了CD4 +子集的T细胞T细胞的CD4 + IL-4和CD4 + FOX + FOX + FOX + FOX-FOX-P3的T细胞分布。此外，与CYP-NOD CON组相比，经过EPE治疗的CYP-NOD小鼠的CD4 + IL-17和CD4 +IFNγ的每10,000个细胞的百分比降低了CD4 + IL-17和CD4 +IFNγ的百分比，并增加了CD4 + IL-4和CD4 + FOXP3的百分比（p <0.001，p <0.05，p <0.05，p <0.05，p <0.05，p <0.05，p <0.05，以及p <0.05，以及p <0.05，以及p <0.05，以及p <0.05，以及）。对于胰腺中的靶基因表达水平，经过EPE处理的小鼠的表达水平降低了TH1细胞的炎性敏感性细胞因子的表达水平，包括IFN-γ和TNF-α，但两只小鼠模型中TH2细胞的IL-4，IL-10和TGF-1β的表达水平提高。Histological examination of the pancreas revealed that EPE-treated mice had not only increased pancreatic insulin-expressing β cells (brown), and but also enhanced the percentage of Bcl-2 (green)/Bax (red) by IF staining analyses of islets compared with the S-NOD Con and the Cyp-NOD Con mice, implying that EPE displayed the protective effects of pancreas β cells.EPE显示出胰腺IRS评分的改善，并且促进敏感性细胞因子的降低。此外，EPE通过调节IL-17表达来施加降血葡萄糖的作用。总体上，这些结果暗示EPE通过调节细胞因子表达来抑制自身免疫性糖尿病的发展。我们的结果表明，EPE在T1D和免疫调节的预防作用中具有治疗潜力。