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World File Search System荧光计
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
AflaTest 使用手册
1.1 预期用户 AflaTest ® 是一种定量检测多种商品中黄曲霉毒素的方法。Vicam 的先进生物技术允许测量所有主要的黄曲霉毒素（包括 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和 AFM1），而无需使用氯仿或二氯甲烷等有毒溶剂。AflaTest ® 黄曲霉毒素检测用于各种各样的地方，从当地农场升降机到食品加工质量控制实验室到政府检测实验室 - 任何快速、简便且高度准确的黄曲霉毒素分析可以防止污染并改善食品供应质量的地方。1.2 原理 黄曲霉毒素是一种来自天然霉菌的毒素，是已被证明会导致人类癌症的一类致癌物。黄曲霉毒素还会因疾病或生产效率降低而导致牲畜遭受经济损失。AflaTest ® 是一种快速、简单、安全且高度准确的方法，可用于定量测量许多商品中的黄曲霉毒素。样品通过与萃取溶液混合、搅拌和过滤来制备。然后将萃取物施加到与黄曲霉毒素特异性抗体结合的 AflaTest ® 柱上。在此阶段，黄曲霉毒素与柱上的抗体结合。然后用水冲洗柱以除去免疫亲和柱中的杂质。通过将甲醇通过柱，黄曲霉毒素从抗体中除去。然后可以将该甲醇溶液注入 HPLC 系统或在荧光计中测量。这些步骤在第 1.7 节“AflaTest ® 概述”中概述。1.3 适用性和批准 AflaTest ® 已针对许多商品中的黄曲霉毒素定量测量进行了优化。目录列出了截至本手册出版日期为特定商品开发的测试协议。如需测量本手册中未列出的商品中的黄曲霉毒素，请联系我们的技术援助部门。AflaTest ® 方法因通过亲和柱的样品量而异。通过柱的样品量越多，检测限越低。但是，当通过柱的样品量较少时，测定范围更广，测试可以更快完成。一般而言，0.2g 方法的检测范围更广，速度更快。1.0g 方法的检测限较低。两种方法均准确。
Roseinatronobacter sp。完整的基因组序列。菌株S2，一种从pH 12蛇形化系统中分离出的化学硫代表营养
s2是从山的Ney Springs中分离出来的Shasta，加利福尼亚州，在最小培养基板上，其中包含20 mM多硫化物和10毫米乙酸盐（6）。S2在含有20 mm硫代硫酸盐和10 mm乙酸盐的液体最小培养基中进行有氧培养。详细的媒体说明可在此处找到：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bqjgmujw。S2在室温下孵育5天，以实现由先前的生长曲线确定的近似最大浊度（6）。DNA，并使用量子荧光计（美国Thermofisher Scientific，USA）进行定量。所有测序均由单个DNA准备。纳米孔库在高智能模式（280 bp/s）下使用R10.4.4的流动池（FLO-MIN114）用天然条形码24 V14试剂盒（牛津纳米孔技术，英国牛津，英国）进行测序。用孔雀鱼V.6.4.6进行，删除了质量分数<7的读数（7）。 在Seqcenter LLC（美国匹兹堡，美国）进行了 Illumina库准备和测序。 简要地，使用Illumina DNA准备套件制备库，并用10 bp独特的双指数进行条形码，并在Illumina Novaseq（2×150个测序）上进行测序。 使用BCL-Convert（v.4.0.3）进行反复式，质量控制和适配器修剪。 纳米孔序列> 2,000 bp用菲尔隆（V.0.2.1）（8）过滤质量，并去除了最差的10％的读取碱基。 过滤的长读数与Flye组装（v.2.9.1）（9）。 进行了四轮抛光。 质量评估和基因组统计数据，删除了质量分数<7的读数（7）。Illumina库准备和测序。简要地，使用Illumina DNA准备套件制备库，并用10 bp独特的双指数进行条形码，并在Illumina Novaseq（2×150个测序）上进行测序。使用BCL-Convert（v.4.0.3）进行反复式，质量控制和适配器修剪。纳米孔序列> 2,000 bp用菲尔隆（V.0.2.1）（8）过滤质量，并去除了最差的10％的读取碱基。过滤的长读数与Flye组装（v.2.9.1）（9）。进行了四轮抛光。质量评估和基因组统计数据Illumina读取的质量是用FastQC（v.0.12.1）（10）过滤的，所有读取的质量得分> Q30。简短的读数与Burrows -wheeler对准器（V.0.7.17）（11）对齐，并用Pilon（V.1.24，-fix all）（12）抛光组件。
补充材料
补充材料。材料与方法文库制备和 Miseq (Illumina®) 测序使用文库制备指南 (LPG) ( https://support.illumina.com/downloads/16s_metagenomic_sequencing_library_preparation.html ) 中报告的 Illumina 接头序列和引物悬垂部分（正向和反向）扩增 16S rRNA 基因的 460 bp V3-V4 高变区。使用以下 PCR 反应扩增每个 DNA 样本：2.5 µl 5 ng/ µl DNA、5 µl 引物正向悬垂部分、5 µl 引物反向悬垂部分、12.5 µl 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems)。使用 LPG 中报告的循环程序。 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶（GellyPhor LE，Euroclone SPA，意大利米兰）上电泳分离，并用 GelRed™ 核酸凝胶染料（Biotium，美国加利福尼亚州海沃德）染色。通过紫外光透射仪观察预期长度的 PCR 产物的存在。然后，用 NucleoMag 试剂盒纯化 DNA 扩增子以清理和选择 NGS 文库制备反应的大小（Macherey-Nagel），并按照制造商的说明使用 Illumina® DNA/RNA UD Indexes Tagmentation 试剂盒对每个样本进行索引。在验证和定量之前，对文库进行进一步纯化。在 Agilent 4150 TapeStation D1000 ScreenTape 检测仪（安捷伦科技公司）上对文库进行验证，以验证大小，而定量则使用 Qubit 4 荧光计（赛默飞世尔科技，美国）。根据 DNA 扩增子的大小，应用 Illumina LPG 中报告的公式，以 nM 为单位计算最终的 DNA 浓度。最后，将每个文库中的 5 µl 稀释 DNA 等分试样混合，以合并具有唯一索引的文库。在 Miseq 加载之前，根据 Illumina LPG 说明对合并的文库进行变性和稀释。使用 MiSeq Reagent Micro Kit v2（500 个循环）加载合并的文库，运行包括 20% PhiX 作为内部对照。生物信息学分析测序数据包含在包含带有原始读取的 FASTQ 文件的文件夹中（R1 文件包含每个样本的正向读取，R2 文件包含每个样本的反向读取），使用 FastQC（英国剑桥 Babraham Institute）进行质量检查。然后，使用 DADA2 R 包（Callahan 等人，2016 年）处理 R1 和 R2 文件以生成扩增子序列变体 (ASV)（图 1）。最终生成了 ASV 表，总结了每个样本的不同 ASV 的数量。
全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环