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World File Search System诱变
B细胞恶性肿瘤的正向和反向遗传学 硝酸盐对高血压患者口服微生物组和唾液生物标志物的影响 潮汐流与风能：与混合系统中短期存储结合使用的循环功率的值
癌症基因组测序已鉴定出数十个突变，在淋巴作用和白血病发生中起作用。验证负责B细胞肿瘤的驱动突变的验证是值得研究的突变体积以及由B细胞发育不同阶段引起的多个突变的复杂方式而变得复杂的。小鼠的正向和反向遗传策略可以提供对人类驱动基因的互补验证，在某些情况下，这些模型的人肿瘤的比较基因组学指导了对人类恶性肿瘤中新驱动因素的鉴定。我们回顾了使用插入诱变，化学诱变和外显子组测序进行的前向遗传筛选的集合，并讨论如何使用人类肿瘤基因组识别插入性诱变筛查中插入性诱变筛查中的高渗透覆盖范围如何鉴定在无法使用人类肿瘤基因组的速度下进行合作的突变。我们还比较了一组从PAX5突变小鼠中进行的独立进行的筛选，该筛网会在人类急性淋巴细胞性白血病（ALL）中观察到的一组常见突变集合。我们还讨论了使用CRISPR-CAS，ORF和SHRNA的反向遗传模型和筛选，以提供高吞吐量的体内证据，以实现致癌功能，重点是使用经体培养细胞的收养转移模型。最后，我们总结了在体内环境中提供候选基因的时间调节的小鼠模型，以证明其编码蛋白作为治疗靶标的潜力。
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I.简介（1）2药物的合成涉及使用反应性化学物质，试剂，溶剂，催化剂和其他加工辅助物。由于化学合成或随后的降解，杂质存在于所有药物和相关的药物中。尽管国际统一委员会（ICH）新药物质中的工业Q3A杂质指南（修订2）（ICH Q3A）（2008年6月）和新药产品中的Q3B（R2）杂质（ICH Q3b（r2））（2006年8月）（参考（参考）（参考）1，2）为大多数杂质提供了指导和控制的指导，为DNA反应性的那些杂质提供了3个有限的指导。本指南的目的是提供一个适用于这些诱变杂质的识别，分类，资格和控制以限制潜在的致癌风险的实用框架。本指南旨在补充ICH Q3A，ICH Q3B（R2）（注释1）和ICH行业M3（R2）非临床安全研究指南，用于进行人体临床试验和制药的营销授权（2010年1月）（参考文献。3）。本指南强调考虑安全和质量风险管理的考虑，以建立诱变杂质的水平，这些杂质有望带来可忽略的致癌风险。概述了对居住或合理期望居住在最终药物或产品中的诱变杂质评估和控制的建议，考虑到人类使用的预期条件。一般而言，FDA的指导文件并未确定合法可执行的责任。相反，指南描述了该机构对某个主题的当前思考，除非引用特定的监管或法定要求，否则应仅将其视为建议。
用于基因敲除和转录调控的 PAM 柔性 Cas9 变体的高通量筛选
1. 纽约基因组中心，纽约，纽约州，美国 2. 纽约大学生物学系，纽约，纽约州，美国 3. 这些作者贡献相同 * 电子邮件：neville@sanjanalab.org 关键词：Cas9、诱变、汇集 CRISPR 筛选、CRISPRa、CRISPRi、原间隔区相邻基序
对肺炎链球菌NADPH氧化酶的结构和机械见解
烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）通过介导活性氧的产生，在真核细胞的生理学中具有重要作用。在细菌中发现了具有NOX催化核心的进化较远的蛋白质，包括肺炎链球菌NOX（SPNOX），该蛋白质被认为是研究NOX的模型，因为其在洗涤剂胶束中具有较高的活性和稳定性。我们在这里提出了无底物和烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）结合的SPNOX以及NADPH结合的野生型和F397A SPNOX的冷冻电子显微镜结构。这些高分辨率结构提供了对电子转移途径的见解，并揭示了由F397位移调节的氢化物转移机制。我们进行了结构引导的诱变和生化分析，这些诱变解释了对NADPH的底物特异性的缺乏，并提出了组成型活性背后的机制。我们的研究提出了结构基础SPNOX酶活性，并阐明了其体内功能的潜力。
创造遗传多样性：释放蛋白质进化的潜力
摘要：遗传多样性是生物体进化复原力、适应潜力和旺盛生命力的基础，是生态系统健全和地球生命不断进化的基石。定向进化是一种受自然进化过程启发的强大生物技术工具，在产生遗传多样性的创新策略的推动下，定向进化格局发生了变革性的变化。这种转变受到多种因素的推动，包括使用 CRISPR-Cas 和碱基编辑器等先进工具包、对生物机制的理解加深、具有成本效益的定制寡核苷酸池合成以及人工智能与自动化的无缝集成。这篇全面的综述研究了用于构建体外和体内基因文库的各种方法，分为三大类：随机诱变、聚焦诱变和 DNA 重组。本综述的目的有三：首先，全景概述遗传多样性创造的最新进展；其次，激发遗传多样性生成的进一步创新新思路；第三，为进入定向进化领域的个人提供宝贵的资源。
利用 CRISPR/Cas9 诱变技术对性信息素的生物合成进行调控，导致甜菜夜蛾（一种害虫）失去雌性吸引力
已知处女雌蛾会释放性信息素来吸引同类雄性。准确的性信息素是它们进行化学交流的必要条件。鳞翅目昆虫甜菜夜蛾的性信息素含有在第12个碳位置上有双键的不饱和脂肪酸衍生物。甜菜夜蛾的去饱和酶 ( SexiDES5 ) 被认为具有双重功能，它通过在第11和12个碳上形成双键来合成Z9,E12-十四碳二烯酸，该酸可乙酰化为主要的性信息素成分Z9,E12-十四碳烯酸乙酸酯 ( Z9E12-14:Ac )。利用 CRISPR/Cas9 构建了 SexiDES5 的缺失体，并进行近交繁殖以获得纯合子。突变雌蛾不能产生Z9E12-14:Ac以及Z9-14:Ac和Z11-14:Ac。突变雌蛾的信息素提取物也不能在雄蛾触角中诱发感觉信号。它们也不能诱导雄蛾的交配行为，包括毛笔竖立和定向。在田间，这些突变雌蛾不能吸引任何雄蛾，而对照雌蛾可以吸引雄蛾。这些结果表明SexiDES5能够催化第11和12位上的去饱和作用，从而产生S . exigua的性信息素成分。这项研究还表明，通过产生没有吸引力雌蛾，基因组编辑技术可以应用于害虫防治。
利用通用供体快速生成可逆和条件等位基因的 HIT 捕获策略
在模型生物中定向诱变是基因功能注释和生物医学研究的关键。尽管 CRISPR-Cas9 系统在基因编辑方面取得了技术进步，但在大型动物模型中快速有效地引入定点突变仍然是一个挑战。在这里，我们开发了一种强大而灵活的插入诱变策略，即同源性独立的靶向捕获 (HIT-trapping)，它是通用的，可以有效地靶向捕获内源性目的基因，而不依赖于同源臂和胚胎干细胞。进一步优化并为 HIT-trap 供体配备位点特异性 DNA 倒置机制，可以在单个实验中一步生成可逆和条件等位基因。作为概念验证，我们成功地在原代猪成纤维细胞中为 21 种疾病相关基因创建了突变等位基因，平均敲入频率为 53.2%，比以前的方法有了很大的改进。这里提出的多功能 HIT 捕获策略有望简化突变等位基因的靶向生成，并促进猪等大型哺乳动物的大规模诱变。
基于系统的基于图像的基于斑马鱼幼虫中复杂性状的遗传筛选
摘要具有数以千计的基因组关联研究对复杂特征鉴定的基因座，需要在体内模型系统中可靠，迅速推断大量候选基因的作用。基于F 0斑马鱼中的基于CRISPR/CAS9的功能屏幕代表这样的系统。然而，到目前为止使用的负面对照 - 包括加扰的指南RNA（GRNA），灭活的CAS9和假注射 - 不会引起与CRISPR/CAS9相同的细胞和有机反应，并且可能会加剧结论。在这里，我们表明，靶向KITA促进了成功的诱变，更高质量的成像数据以及病例和对照的有效分类的有效的光学预筛查。我们鉴定并测试了两个靶向具有类似高诱变效率和对色素作用的kita的GRNA，并且没有对心脏代谢性状的脱靶效应或主要影响。我们提出了几种方法，这些方法将得出有效的，公正的结论。
农业基因组编辑领域不断发展的格局
在欧洲，欧盟法院 (ECJ) 于 2018 年裁定，所有基因组编辑生物均须归类为转基因生物 (GMO)，因此须根据欧盟转基因指令 (框 1) 承担沉重的监管负担。尽管化学和辐射诱变技术不受该指令的约束，但欧洲法院裁定，基因组编辑不能获得豁免 [1]，因为这些技术是在转基因指令制定之后开发出来的。此外，欧洲法院解释说，对基因组编辑产品的豁免不符合法律精神，而使用常规诱变技术开发的产品则因具有安全使用历史而获得豁免。除欧盟外，只有新西兰根据其转基因生物安全规则对基因组编辑进行监管，也是通过法院判决。欧洲法院的裁决让科学家们困惑，并对农业创新产生了负面影响。大型农业公司将其先进的育种项目迁出了欧洲。农业领域 CRISPR 专利中只有 8% 来自欧洲，60% 来自中国，26% 来自美国 [2]。批评人士呼吁新一届欧盟委员会
鉴定人类细胞中复制应力反应的关键因素Louise M.E. Janssen 1，Empar Baltasar Perez 1，Chantal Vaartin
方法在补充了10％FCS，1％谷歌补充剂（Gibco），100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉菌素的IMDM（Gibco）中培养了衍生成近单倍型HAP1细胞的细胞培养。siRNA转染是根据制造商的指南使用Rnaimax（Invitrogen）进行的。在这项研究中使用了以下siRNA：Sinon-targetable（Dharmacon），Sipolg2（地平线，TargetPlus，SmartPool），SIMRPL23（Horizon，Targetplus，TargetPlus，Smartpool）。将所有药物（Aphidicolin，Hu，Olaparib，Rad51i（B02），DNA-PKI（NU74441）和寡霉素A）溶解在DMSO中，并以指示浓度使用。细胞使用具有137CS源的γ提取器（最佳疗法）进行γ辐射。生长测定HAP1细胞以1500个细胞/孔的密度将HAP1细胞铺在96孔板中，并被视为5天。5天后，使用100％甲醇固定细胞，并在室温下使用Crystal Violet染色2H。随后，将晶体紫溶解在10％乙酸中，并使用Biotek Epoch Epoch分光光度计在595 nm处测量强度。使用非线性拟合，sigmoidal，4pl，x是log（浓度），将这些测量值用于棱镜中的IC50计算。在9mm玻璃盖上生长免疫荧光细胞，并在室温下以4％甲醛和0.2％Triton X-100固定10分钟。使用了以下抗体：人类抗克雷斯特（Cortex Biochem，CS1058），兔抗PH3SER10（Campro，＃07-081），小鼠抗ERCC6L（PICH）（ABNOVA，ABNOVA，000548421-B01P）。所有初级抗体在4°C的夜间孵育。使用固定缓冲液I（BD生物科学）固定细胞。细胞。二级抗体（分子探针，Invitrogen）和DAPI在室温下孵育2小时。使用延长金（Invitrogen）安装盖玻片。使用具有60倍1.40 Na油目标的Deltavision Deonvolution显微镜（Applied Precision）获取图像。SoftWorx（应用精度），ImageJ，Adobe Photoshop和Illustrator CS6用于处理获得的图像。单倍体插入诱变筛选基因对用APH或HU处理的HAP1细胞的存活至关重要，如先前所述35，使用单倍体插入诱变筛查鉴定。诱变的HAP1细胞是从Brummelkamp实验室获得的。简短地，获得HAP1细胞的诱变如下：在HEK293T细胞中产生了基因陷阱逆转录病毒。每天两次收获逆转录病毒至少三天，并通过离心（使用SW28转子进行2小时，21,000 rpm，4°C，4°C）进行沉淀。在8μg/ml硫酸素硫酸素的存在下，在T175烧瓶中至少连续两天，在8μg/ml硫酸素的存在下，将大约4000万个HAP1细胞通过浓缩基因陷阱病毒的转导而被诱变。在包含10％DMSO和10％FCS的IMDM培养基中冷冻诱变细胞。解冻后，在存在27.5 nm adphidicolin或100μmHu的情况下，将诱变的HAP1细胞转移了10天。传递后，通过胰蛋白酶-EDTA收集细胞，然后进行沉淀。为了最大程度地减少潜在地含有杂合突变的二倍体细胞的混杂，用DAPI染色固定的细胞，以允许使用Astrios Moflo对G1单倍体DNA含量进行分类。将3000万个排序的细胞在56°C下裂解过夜，以使使用DNA迷你试剂盒（QIAGEN）进行基因组DNA分离。插入位点映射基因陷阱插入位点通过LAM-PCR放大，然后进行捕获，ssDNA接头连接和指数放大，并在测序之前使用含有Illumina适配器的引物，如前所述，如前所述35。映射和插入位点的分析以前描述了78。简短地，在对HISEQ 2000或HISEQ 2500（Illumina）进行测序之后，将插入位点映射到人类基因组（H19），允许一个不匹配，并与RefSeq坐标相交，以将插入位点分配给基因。基因区域在相对链上重叠的基因区域没有考虑进行分析，而对于在相同链基因名称上重叠的基因是串联的。对于每种复制和两种药物治疗（APH或HU）基因的必要性都是通过二项式检验确定的。合成致死性。一个基因通过所有Fisher的测试，其p值截止为0.05，效应大小至少为0.12（减法比率wt sense比率 - 复制应力条件感官比率）。