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在sgrna的硅设计中用于CRISPR/CAS9介导的...
快速碱化因子（RALFS）是植物中存在的普遍存在的富含半胱氨酸的肽。它们在各种过程中充当激素信号的功能，包括细胞生长，根部伸长和受精。ralf肽还可以充当植物免疫反应的负调节剂，从而抑制信号受体复合物的形成以进行免疫激活。在Fragaria×Ananassa中，Faralf33基因的沉默在防御真菌病原体Coltetotrichum acutatum中起关键作用。在这项研究中，在硅中设计了单个指南RNA（SGRNA），用于群集间隔间隔短的短静脉体重复序列/CRISPR-相关的（CRISPR/CAS）9介导的Faralf33基因诱变，以减少Ananassa的Ananassa。faralf33与其他植物物种的同源RALF33序列进行了比较，表明Faralf33的氨基酸序列还列出了Rrila蛋白水解位点中已知的Ralf肽的典型序列，除了Faralf33与Fvralf33一起提出的紧密聚类。在线工具Chopchop为Faralf33基因提供了73次命中，选择了两个用于诱变的SGRNA序列，Sgrna 1（5'-cgactctcccatctctctctctcttggact-3'）和sgrna 2（5'-gcaagcaagcaagcaAgcaAcgaCgggCagcgAgcGatca-3'）。所选SGRNA的预测二级结构在靶向诱变中提出了有效的结构。用于CRISPR/CAS9介导的FARALF33基因诱变的PCAS9-TPC-GFP-2XSGRNA载体是在具有两个SGRNA序列（带有两个SGRNA序列（带有拟南芥thaliana u6-26启动子）和绿色荧光蛋白质标记物的硅中设计的。
基因编辑技术在作物育种中研究及应用
[52] Lin，C.S.，Hsu，C.T.，Yang，L.H.，Lee，L.Y.，Fu，J.Y.，Cheng，Q.W.，Wu，F.H. S.B.和Shih，M.C。 （2018）原生质体技术与CRISPR/CAS9诱变的应用：从单细胞突变检测到突变植物再生。 植物生物技术杂志，16，1295-1310。 https://doi.org/10.1111/pbi.12870和Shih，M.C。（2018）原生质体技术与CRISPR/CAS9诱变的应用：从单细胞突变检测到突变植物再生。植物生物技术杂志，16，1295-1310。 https://doi.org/10.1111/pbi.12870
1 TetR 型阻遏物的发散定向进化...
图 1 RolR 诱变、选择和半自动化高通量筛选工作流程。a. 全构象的 RolR 二聚体（PDB：3AQT），以及配体结合口袋的结构，其中残基 D149 为黑色，间苯二酚为青色，5Å 内选择用于诱变的 19 个残基为橙色，5Å 和 8Å 之间的残基为紫色。b. 组合活性位点饱和度测试 (CAST) 的笛卡尔结合口袋图。c. 六个氨基酸组组成了要用于诱变的 19 个残基。d. 生物传感器 TetA 双重选择的原理，使用 NiCl 2 对转录抑制能力进行负向选择，使用四环素对目标配体进行正向选择。e. 半自动化高通量筛选。在第 1 天，为每个候选分子挑选约 500 个菌落。第二天，使用声学液体处理器将 IPTG 和小分子分配到 384 孔板中。生长的菌落被稀释并分配到 384 个孔板中，使用液体处理工作站测试传感器的不同状态。第三天，荧光
利用胞嘧啶碱基编辑进行 CRISPR-Cas 引导的福氏志贺氏菌染色体和毒力质粒诱变
摘要 志贺氏菌是一种革兰氏阴性细菌，可侵入人体肠道上皮。由此引起的感染志贺氏菌病是最致命的细菌性腹泻病。有关决定志贺氏菌病理生理的基因（包括染色体和毒力质粒）的大部分信息都是通过经典反向遗传学获得的。然而，流行的诱变技术的技术限制使得单次反应中只能产生少量突变体，从而阻碍了大规模的志贺氏菌靶向诱变和随后的表型评估。我们采用了一种 CRISPR-Cas 依赖性方法，其中切口酶 Cas9 和胞苷脱氨酶融合在单向导 RNA（sgRNA）的引导下引入靶向 C ！ T 转换，导致内部终止密码子和翻译过早终止。在使用 mCherry 荧光报告基因的原理验证实验中，我们能够在大肠杆菌和志贺氏菌中生成功能丧失突变体，效率高达 100%。使用改进的波动分析，我们确定在优化条件下，由 Cas9 脱氨酶融合引入的非靶向突变的频率与自发突变在同一范围内，这使我们的方法成为细菌诱变的安全选择。此外，我们对该方法进行了编程，以突变已充分表征的染色体和质粒携带的志贺氏菌基因，并发现突变体的表型与已报道的基因缺失突变体的表型相似，在表型水平上没有明显的极性效应。该方法可用于 96 孔板格式，以提高通量并在几天内生成一系列靶向功能丧失突变体。
N-甲基-N-亚硝脲诱变受精卵细胞引起的水稻突变体文库成员的全基因组测序
摘要 尽管靶向基因组编辑技术已成为加速功能基因组学的有力反向遗传方法，但由化学诱变剂诱导的传统突变体文库对于植物研究仍然很有价值。含有化学诱导突变的植物是简单而有效的遗传工具，可以在不考虑生物安全问题的情况下种植。突变体个体的全基因组测序减少了突变体筛选所需的工作量，从而提高了它们的实用性。在本研究中，我们对由用 N-甲基-N-亚硝脲 (MNU) 处理单个受精卵细胞而获得的 Oryza sativa cv. Nipponbare 突变体文库成员进行了测序。通过对该突变体文库中的 266 株 M 1 植物进行全基因组测序，我们总共鉴定出 66 万个诱导点突变。这个结果代表了 373 Mb 组装水稻基因组中每 146 kb 基因组序列中有一个突变。这些点突变均匀分布于整个水稻基因组中，超过 70,000 个点突变位于编码序列内。尽管该突变体文库规模较小，但近 61% 的所有注释水稻基因中均发现了非同义突变，8.6%（3248 个基因）的点突变对基因功能有较大影响，例如获得终止密码子或丢失起始密码子。WGS 表明使用水稻受精卵细胞的 MNU 诱变可有效诱导突变，适用于构建用于计算机突变体筛选系统的突变体文库。扩展该突变体文库及其数据库将提供一种有用的计算机筛选工具，以促进功能基因组学研究，特别是针对水稻。关键词：水稻突变体文库、N-甲基-N-亚硝脲 (MNU)、单核苷酸变体 (SNV)、NGS、计算机 TILLING、水稻、全基因组测序、遗传资源
克雷伯氏菌肺炎中的转座子诱变筛查确定了人类尿液和血清生长所需的遗传决定因素
抽象的克雷伯氏菌肺炎是全球公共卫生的关注，因为无数多种过度呼吸和多药的克隆都与高死亡率相关。基于这些顽固的K.肺炎感染的分子机制，以及如何与几乎所有当今所有临床上重要的抗菌抗菌物质的谱系的毒性与抗性的毒力结合在一起，尚不清楚。在这项研究中，我们在亚洲最常报道的地方性K2-ST375病原体的K.肺炎ECL8中进行了全基因组筛查，以定义对富含营养的实验室培养基生长至关重要的基因（Luria-bertani [LB]培养基[LB]培养基），人类尿液和精神尿液。通过转座子定向插入位点测序（传统），总共427个基因被确定为LB琼脂上生长至关重要，而11和144个基因的转座子插入分别降低了尿液或血清的适应性。这些研究不仅提供了有关该病原体遗传学的进一步知识，而且还为发现新的抗菌靶标提供了强大的动力，以改善肺炎链球菌感染的当前治疗选择。
利用 CRISPR/Cas9 高效修饰玻璃翅神枪手 Homalodisca vitripennis (Germar) 基因组
CRISPR/Cas9 技术可将遗传技术扩展到以前无法进行遗传分析的昆虫害虫。我们报告了在玻璃翅尖足猎蝽 (GWSS) Homalodisca vitripennis 中建立遗传分析的结果，该昆虫是加利福尼亚州农业中一种重要的叶蝉害虫。我们使用一种新颖而简单的方法，在宿主植物上进行原位胚胎显微注射，获得了超过 55% 的朱砂和白色眼色素位点的高频率诱变。通过配对交配，我们获得了 100% 的 w 和 cn 等位基因到 G3 代的传递，并且还确定了这两个基因都位于常染色体上。我们对翅膀表型的分析意外地发现了蝶啶色素参与了翅膀和翅脉着色，表明这些色素的作用不仅限于眼睛颜色。我们利用扩增子测序来检查注射卵对成虫造成的脱靶诱变程度，结果发现脱靶诱变程度可以忽略不计或根本不存在。我们的数据表明，GWSS 可以轻松开发为半翅目昆虫的遗传模型系统，从而能够研究有助于入侵害虫和植物病原体载体成功的特征。这将促进新的遗传控制策略。
![植物生物技术。 23.0525a（2023）[adv.pub。]](/simg/g:\will\search\icon\source\d\d487db999e4f1cf93c146fa75cd24c27419e4718.webp)
植物生物技术。 23.0525a（2023）[adv.pub。]
抽象的转座子是移动遗传元件，可以移动到基因组或基因组之间的不同位置。长期以来，它们一直用作基因工程的工具，包括在各种生物中的转基因，插入诱变和标记切除术。源自白菜循环飞蛾的Piggybac转座子是有史以来最有前途的转座子工具之一，因为PiggyBac的优势是它可以转置而不会在切除的地点留下足迹。将Piggybac Transoson应用于植物中的精确基因组编辑，我们证明了从集成到水稻基因组中的转基因基因座的有效且精确的Piggybac Transposon切除。此外，只能通过同源重组介导的基因靶向靶靶标的精确基因修饰的结合以及使用PiggyBac Transposion通过大米中的piggyBac转置从靶基因座进行切除，从而实现了仅将所需点突变引入靶基因。此外，我们为piggybac介导的转带系统设计了序列特异性核酸酶的临时表达，以消除从宿主基因组中的转基因，而无需在成功诱导靶向诱变通过序列特异性核酸盐中促进靶向诱变后，在未经不必要的序列中使用。在这篇综述中，我们总结了我们以前的作品以及Piggybac Transposon基因工程的未来前景。