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World File Search System质粒
CRISPR/Cas9 敲除质粒
CRISPR/Cas 系统是一种适应性免疫防御机制，古细菌和细菌利用该系统降解外来遗传物质。在这些生物体中，噬菌体的外来遗传物质被获取并整合到 CRISPR 基因座中 (1,2)。这种新物质也称为间隔物，可产生序列特异性片段，用于未来抵抗噬菌体感染。这些序列特异性片段被翻译成短 CRISPR RNA (crRNA)，并通过 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的核酸酶活性引导互补入侵 DNA 的切割，该蛋白也由 CRISPR 基因座编码 (1,2)。II 型 CRISPR 系统的 Cas9 核酸酶具有 RNA 结合域、α 螺旋识别叶 (REC)、包括用于 DNA 切割的 RuvC 和 HNH 的核酸酶叶以及原间隔物相邻基序 (PAM) 相互作用位点 (1,2)。 crRNA 通过与 REC 叶内的桥螺旋结合与 Cas9 核酸酶形成复合物，并与 crRNA 的骨架形成多个盐桥 (1,2,3)。
比较mRNA和质粒的有效性
摘要自适应CAR-T细胞疗法是一种创新的肿瘤学方法，它使用遗传修饰的T细胞作为打击癌症的治疗工具。与病毒向量相比，在体外（IVT）mRNA作为获得CAR-T淋巴细胞的载体的使用具有多个优点，例如：缺乏细胞基因组的修饰，高效率的转染效率，速度，速度，速度，速度的高效率和最终产物的潜在降低成本。使用模型DNA-肾脏（PMAXGFP）和IVT MRNK（MRNK-GFPP）（MRNK-GFPP）编造在外周血和远处培养细胞的单核细胞（人类肾脏的胚胎细胞，HEK293）的工作中研究了使用DNA-PlazMIDA模型（PMAXGFP）和IIVT MRNK（MRNK-GFPPPRERETION ENCODENTENT）， GFP）。 已经进行了最佳转染模式的选择。 表明，尽管MRNK-GFP给出了表达GFP，细胞活力的细胞数量可比数量，因此，当使用mRNA-GFP作为载体时，转染的有效性显着更高。 同时，用两种方法传递的细胞表达水平的比较表明，mRNA的使用给出了更均匀的指标，而当使用质粒载体时，表达水平的水平差异几个数量级。 比较了转染后7天内表达水平的变化。在外周血和远处培养细胞的单核细胞（人类肾脏的胚胎细胞，HEK293）的工作中研究了使用DNA-PlazMIDA模型（PMAXGFP）和IIVT MRNK（MRNK-GFPPPRERETION ENCODENTENT）， GFP）。已经进行了最佳转染模式的选择。表明，尽管MRNK-GFP给出了表达GFP，细胞活力的细胞数量可比数量，因此，当使用mRNA-GFP作为载体时，转染的有效性显着更高。同时，用两种方法传递的细胞表达水平的比较表明，mRNA的使用给出了更均匀的指标，而当使用质粒载体时，表达水平的水平差异几个数量级。比较了转染后7天内表达水平的变化。表明，GFP阳性细胞的份额随着时间的推移而降低，并且不取决于转染的方法，而对可行细胞的份额的评估表明，使用plasmida的转移会导致7天后可行细胞的份额降低至30％，而mRNA的使用实际上不会影响7天的使用情况（实际上与7天相差不同）。获得的结果表明，使用IVT mRNA可以是通过电穿孔生产CAR-T产品的更可取的工具。
在常用合成生物学质粒中防止质粒多聚体形成
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证（未获得同行评审证书）获得的是作者/资助者，他已授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。这是该版本的版权所有，该版本于2024年7月24日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.07.23.604805 doi：Biorxiv Preprint
针对含有...的质粒编码蛋白质
摘要 抗菌素耐药性 (AMR) 对人类健康构成重大威胁。尽管已经开发出疫苗来对抗 AMR，但将特定疫苗抗原与 AMR 关联起来却极具挑战性。细菌质粒在 AMR 的传播中起着至关重要的作用。我们最近的研究发现了一组细菌质粒（具体来说，IncHI 质粒），它们编码含有细菌免疫球蛋白样结构域的大分子量蛋白质。这些蛋白质位于细菌细胞的外表面，例如鞭毛或接合菌毛中。在这项研究中，我们表明这些蛋白质具有抗原性，可以保护小鼠免受携带其中一种质粒的 AMR 沙门氏菌菌株引起的感染。此外，我们成功生成了针对这些蛋白质的纳米抗体，这些纳米抗体被证明可以干扰 IncHI 质粒的接合转移。考虑到这些蛋白质也编码在其他质粒组中，例如 IncA/C 和 IncP2，针对它们可能是对抗由携带不同组 AMR 质粒的细菌引起的 AMR 感染的有效策略。由于选定的抗原与 AMR 本身直接相关，因此保护作用不仅限于特定微生物，还包括所有携带相应抗性质粒的微生物。
基于存储库的质粒设计
过去十年，序列库中可商用 DNA 的数量呈爆炸式增长。在三大最大的 DNA 库：iGEM、Addgene 和 DNASU 中，此类质粒的数量从 12,000 个增加到 300,000 多个。生物设计中的一个挑战仍然是如何有效、正确和无缝地使用这些和其他基于库的序列。这项工作描述了一种质粒设计方法，其中质粒被指定为简单的 DNA 序列或特征列表。然后，所提出的软件通过 Gibson assembly ® 找到最具成本效益的合成和 PCR 制备的库片段组合来构建质粒。它在用户指定和公共 DNA 数据库中查找现有的 DNA 序列：iGEM、Addgene 和 DNASU。引入并针对 2005 年之后的所有 iGEM 复合部件和 2018 年提交的所有 Addgene 载体进行了此类软件应用程序的描述，结果发现与纯合成质粒设计方法相比，成本降低了 34%。所述软件将通过缩短设计时间、提高构建质量和降低成本来改进当前的质粒组装工作流程。
导航大规模质粒DNA纯化
先前用于质粒DNA（PDNA）纯化的小规模方法无法满足该行业对足够数量的需求。大量的细菌裂解物是较大的体积发酵的结果，传统的大规模下流净化过程具有一些缺点和局限性。市场被认为会继续扩展，因此需要有效，具有成本效益和可扩展的纯化过程的需求显而易见。在pDNA产量和纯度之间存在至关重要的权衡，因此需要在色谱量化步骤中进行仔细考虑。每个步骤都会提高纯度，同时牺牲产量。为了达到更高程度的pDNA产量，最佳纯化需要一个单一的构图步骤，特别是与过滤结合的阴离子交换色谱（AEX）。另外，建议采用涉及AEX的两步纯化方法，然后是疏水相互作用色谱法（HIC），以消除互补杂质并达到高纯度。此外，建议使用整体色谱支撑物的利用来促进纯粹的纯化策略。这是由于整体促进了较高的结合能力，即使在高流速下，也可以确保稳健和一致的结果。
p120 HDR 质粒 (h): sc-400943-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
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