购买本产品即表示买方获得不可转让的权利,可使用所购买的产品数量以及所有复制品和衍生物,仅用于买方在其实验室进行的研究目的(无论买方是学术实体还是营利实体)。买方不得向第三方出售或以其他方式转让(a)本产品(b)其组件或(c)使用本产品或其组件制成的材料,或以其他方式将本产品或其组件或使用本产品或其组件制成的材料用于商业目的。
整个质粒和Amplicon Express的测序配置为150bp配对的末端。因此,索引ED扩增子的长度应在150-250bp之间(这是靶向扩增子的长度减去NEX TERA标签)。在同一测序运行中具有不同大小的放大器,例如两个极端:150bp和250bp,可能会产生不同数量的测序读数。这是由于较小尺寸群集的扩增子在流动池上更有效地簇,从而导致其在测序池中较高的表示(从而产生更多数据)。AGRF将采用汇总偏移量来解释大小的差异,并最大程度地减少测序读数的可变性。短PCR扩增子不应包含任何内部修饰,荧光团或深色淬火器。服务仅在珀斯可用。4.0样本提交要求
默认情况下,将RNase H处理的RNA结构折叠为RNA结构,以创建用于DNA聚合酶I(pol I)的底物以启动DNA复制。反义RNA是由重叠基因产生的,如果允许该基因与RNA底漆相互作用,则会诱导不启动DNA复制的替代折叠。由于反义RNA的浓度与质粒副本成正比,因此作为拷贝控制负反馈回路。(b)10
NucleoMag ® 质粒程序利用改良的碱性裂解方案,并在适当的缓冲条件下将核酸可逆地吸附到顺磁珠上。沉淀的细菌在缓冲液 A1 中重新悬浮。通过裂解缓冲液 A2 从细胞中释放质粒 DNA,随后使用缓冲液 S3 中和并沉淀裂解物。粗裂解物可以通过离心或使用 NucleoMag ® 清除珠(专门用于裂解物清除的顺磁珠)来清除。为了将核酸与顺磁珠结合,将结合缓冲液 PAB 和 NucleoMag ® M-Beads 添加到清除的裂解物中。磁分离后,通过专利解毒缓冲液 ERB 去除内毒素和蛋白质。使用洗涤缓冲液 AQ 和风干去除其他污染物(如盐或残留乙醇)。纯质粒 DNA 用低盐洗脱缓冲液或水洗脱,可用于任何常见的下游应用,包括转染(仅供研究使用)。NucleoMag ® 质粒试剂盒专为在自动磁棒系统上使用而设计。
在此应用中,pDNA细胞裂解物在超滤步骤中首先浓缩10倍。然后,用Tris-Edta(TE)缓冲区完成了透明缓冲区的交换。这种UF/DF工艺历史上是使用堆叠的盒式盒子进行的,该盒子具有1.5 m 2的总有效过滤区域(EFA)。Seprapor®空心纤维进行小尺度(0.023 m 2)实验进行评估,然后按缩放到生产运行(0.4,0.8 m 2)。将此UF/DF过程与历史处理条件与盒式录音带进行比较,突出了UFSeprapor®空心纤维过滤器的几种处理优势,以纯化PDNA的TFF纯化。
图1。基于质粒的CRISPR敲入的高度提高的克隆效率:(a)泳道1:NEB®DNA梯子标准(N3200S);泳道2:标准NEB®Q5PCR方案30个周期的Q5 PCR方案基于光涂抹和〜300bp的额外不需要的PCR产物导致过多的DNA,可重复出现30个周期。车道3-8:优化PDD162扩增的PCR循环编号。基于此数据,我们选择了15个周期作为PDD162所有后续扩增的最佳数字。(b)过多的PCR产物和DPNI消化不足会导致约35%的KLD连接克隆是错误的CAS9/SGRNA质粒。相反,优化PCR和KLD连接反应会导致90%的克隆具有正确的GRNA插入。(c)载体主链和用于
定期间隔间隔的短质体重复序列(CRISPR)和与CRISPR相关的蛋白质(CAS9)系统是ARCHEA和细菌使用的一种适应性免疫反应防御机制,用于降解前遗传材料。该机制可以用于其他功能,包括用于哺乳动物系统的基因组工程,例如基因敲除(KO)(KO)(1,2)和基因激活(3-6)。CRISPR Activation Plasmid products enable the identification and upregulation of specific genes by utilizing a D10A and N863A deactivated Cas9 (dCas9) nuclease fused to a VP64 acti- vation domain, in conjunction with sgRNA (MS2), a target-specific sgRNA engineered to bind the MS2-P65-HSF1 fusion protein (6).这种协同激活介质(SAM)转录激活系统提供了一个强大的系统,以最大程度地激活内源基因表达(6)。
1加州大学伯克利分校的创新基因组学研究所,伯克利,加利福尼亚州94720,美国†这些作者对这项工作也同样做出了贡献:杰米·欧文(Jamie Irvine),吉利亚萨·阿罗拉(Jamie Irvine),吉利亚萨·阿罗拉(Jigyasa Arora),杰纳森·阿罗拉(Jigyasa Arora),乔纳森(Jonathan N.V. Martinson)能够复制。专注于质粒作为最小复制系统,我们开发了Origen,这是一种语言模型,在维持基本功能元素的同时,会产生复制的新质粒起源。我们在实验上验证了Origen创建功能起源的能力,该功能与现有野生类型不同,这表明了该模型捕获生物复制的复杂且经常神秘的机制的能力。