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表达异源重组酶的植物中同源重组的刺激
背景：CRISPR/Cas 和 TALEN 技术的进步激发了人们对植物基因编辑机会的兴奋。CRISPR/Cas 被广泛用于通过诱导靶向双链断裂 (DSB) 来敲除或修改基因，而双链断裂主要通过易出错的非同源末端连接或微同源介导的末端连接进行修复，从而导致可能改变或消除基因功能的突变。尽管此类突变是随机的，但它们发生的频率足以使有用的突变能够通过筛选定期识别。相比之下，用替代等位基因或具有特定特征修饰的拷贝替换整个基因的基因敲入目前还不常见。通过同源定向修复进行基因替换（或基因靶向）在高等植物中发生的频率极低，使得筛选有用事件变得不可行。通过抑制非同源末端连接和/或刺激同源重组 (HR) 可以增加同源定向修复。在这里，我们通过评估多种异源重组酶表达对烟草植物染色体内同源重组 (ICR) 的影响，为提高基因置换效率铺平了道路。结果：我们在含有高度敏感的 β -葡糖醛酸酶 (GUS) 型 ICR 底物的烟草转基因系中以不同的组合表达了几种细菌和人类重组酶。使用病毒 2A 翻译重编码系统实现了多种重组酶的协调同时表达。我们发现大多数重组酶在花粉中显著增加了 ICR，其中 HR 将由减数分裂期间发生的程序化 DSB 促进。DMC1 表达在初级转化体中产生了对 ICR 的最大刺激，其中一种植物的 ICR 频率增加了 1000 倍。对纯合 T2 植物系中的 ICR 的评估表明，ICR 增加了 2 倍到 380 倍，具体取决于表达的重组酶。相比之下，营养组织中的 ICR 仅适度增加，异源重组酶的组成性表达也降低了植物的育性。结论：异源重组酶的表达可以大大增加植物生殖组织中 HR 的频率。将此类重组酶表达与使用 CRISPR/Cas9 诱导 DSB 相结合可能是从根本上提高植物基因替换效率的途径。
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从生物体产生的抽象二级代谢产物是与生物的生长直接相关的化合物，而是对它们在自然界中的许多重要目的。萜烯和萜类化合物形成由萜烯合酶（TPS）酶产生的二级代谢产物的一部分。真菌物种高度依赖于二级代谢产物，尤其是萜类化合物，用于许多适应性任务，例如防御和共生关系的形成。与植物物种相比，萜烯和萜类化合物在真菌和大量真菌物种中的重要性，但真菌基因组中相应的TPS基因的研究要比植物中的研究要小得多。在这项工作中，作为UCPH大型研究的一部分，研究了未开发的可食用真菌物种的TPS，以促进酶的特征和产品探索。31 TPSs enzymes from fungal genomes of shiitake mushroom Lentinula edodes, oyster mushroom Pleurotus ostreatus , porcini mushroom Boletus edulis , jelly fungus Auricularia subglabra and cheese fungi Penicillium roqueforti , Penicillium biforme , and Penicillium camemberti were expressed.使用尿嘧啶特异性切除试剂（用户）克隆技术在酵母中通过多拷贝质粒引入基因，将质粒与诱导型GAL1启动子一起构建质粒。使用气相色谱质谱法（GC-MS），用顶空固相微挖掘（HS-SPME）在体内分析产物。从结果可以得出的结论是，三个TPS主要产生单萜，九个TPSS，主要是倍半萜烯和一个TPS主要是二萜。检测到一个没有提供名称的假定倍半萜，以及在真菌物种中找不到的曲线素烯和sinularene和myltayl-4（12）烯。单二烯合酶（Mono-TPSS）属于大多数的Ascomycota Phylum和倍半甲氧苄酯合酶（sesqui-TPSS），而大多数人都属于BASIDIOMYCOTA PHYLUM。TPS基因的催化活性被追溯到系统发育树，尤其是在一个簇中产生单萜的TPSS，在另一个群集中产生sesquiterpenes，在另一个群集中产生倍苯二甲酸酯。另外的实验ERG20P（N127W）的表达是一种被描述为在酵母细胞中累积GPP的基因，导致倍半萜烯的意外增加。此外，将三分之一的转化体诱导到缓冲培养基（pH 6.5）中，以分析pH和酶活性之间的相关性。缓冲诱导导致除三个仍未显示未萜烯峰的经过测试的非活性转化体外，所有倍半萜的产生。