• 建议戴上手套并使用无核酸酶试管和试剂以避免 RNase 污染。 • 始终保持无菌技术,并使用无菌过滤移液器吸头。 • 所有 EditCo 试剂应根据制造商的建议储存。 • 合成 sgRNA 应溶解在 TE 缓冲液中,并使用无核酸酶水稀释至工作浓度。请参阅 EditCo.com/resources 以查找与溶解和储存合成 sgRNA 相关的最佳实践。 • RNP 可直接在 Nucleofector™ 溶液中形成。 • RNP 复合物在室温下可稳定保存长达 1 小时(可在 4°C 下保存长达一周,或在 -20°C 下保存长达 1 个月)。请注意,在 4°C 下储存的 RNP 可能会在长时间后受到微生物生长的污染。
斑马鱼是发育和生物医学研究中广泛使用的模型生物,具有体外受精、胚胎透明和与人类遗传相似等优点。然而,将外源遗传物质引入斑马鱼胚胎的传统方法,尤其是显微注射,带来了巨大的技术挑战并限制了通量。为了解决这个问题,我们开发了一种新方法,利用 Lipofectamine LTX 通过脂质转染将核酸有效地递送到斑马鱼胚胎中。我们的方案绕过了显微注射的需要,提供了一种经济高效、高通量且用户友好的替代方案。该方案概述了斑马鱼基因递送的新策略,以提高该模型系统中遗传研究的效率和范围。
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摘要:脂质纳米颗粒 (LNP) 介导的核酸疗法,包括 mRNA 蛋白质替代疗法和基因编辑疗法,在治疗神经系统疾病(包括神经退行性疾病、脑癌和中风)方面具有巨大潜力。然而,全身给药后将 LNP 递送至血脑屏障 (BBB) 仍未得到充分探索。在这项工作中,我们设计了一个用于 BBB (HTS-BBB) 的高通量筛选 transwell 平台,专门针对筛选 mRNA LNP 进行了优化。与大多数仅评估跨内皮单层运输的 transwell 检测不同,HTS-BBB 同时测量 LNP 运输和内皮细胞本身的 mRNA 转染。然后,我们使用 HTS-BBB 筛选由结构多样的可电离脂质制成的 14 个 LNP 库,并通过验证静脉注射后将 mRNA 递送到小鼠大脑的主要候选物来证明它可以预测体内性能。展望未来,该平台可用于筛选大量针对大脑的 LNP 库,以用于一系列蛋白质替代和基因编辑应用。关键词:脂质纳米颗粒、mRNA、脑输送、血脑屏障
转染级聚乙烯亚胺(PEI)是一种强大的,可信赖的且具有成本效益的试剂,被广泛认为是当前体外和体内转染的当前金标准。pei具有高密度的质子氨基基团,每三分之一原子具有氨基氮。这几乎在任何pH值下都具有高缓冲能力。因此,在内体内,PEI破坏了液泡并将遗传物质释放到细胞质中。与DNA,有效进入细胞的稳定络合以及逃脱内体的能力使PEI成为高效的转染试剂,这对于广泛的细胞系/类型兼容,包括最常用的HEK293和在粘附和悬浮培养物中生长的最常用的HEK293和CHO细胞。
批量描述01263642 0.5 KU TAQ DNA聚合酶(rec。)2655825 2 x 1.25 ml 10x TAQ缓冲液(NH4)2SO4 2667128 2 x 1.25 ml 10x TAQ缓冲液与KCl 2655522 2 x 1.25 ml 25mm 25mm 25mm mgcl2
以下是使用 DharmaFECT™ 1-4 转染试剂(目录号 T-2001、T-2002、T-2003、T-2004)将合成向导 RNA 转染到表达 Cas9 的培养哺乳动物细胞中的简化方案。合成向导 RNA 可以是合成的单向导 RNA,也可以是与 tracrRNA 复合的合成 crRNA。适用于完成细胞系优化后使用。有关完整详细信息以及优化指南,请参阅技术手册。
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统已成为修改多种细胞类型基因表达的重要工具,在肿瘤治疗中显示出前所未有的潜力 (2)。许多研究已将 CRISPR/Cas9 应用于治疗相关的体外和体内实验 (3)。然而,由于 Cas9 蛋白的尺寸较大 (160 kDa),CRISPR/Cas9 的应用受到限制。迫切需要高效、安全地将 CRISPR/Cas9 递送到 AML 细胞中以探索新的治疗靶点。近年来,CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物已通过电穿孔直接递送到肿瘤细胞中,由于 RNP 复合物的寿命短,脱靶效应减少 (4-9)。