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无甘油T4 DNA连接酶（HC） 产品处理指南
储存和稳定性： 无甘油 T4 DNA 连接酶（ HC ）采用蓝冰运输。到货后储存于 -20°C 下，以获得最佳稳定性。应避免反 复冻融循环。 有效期： 在外包装盒标签上的有效期内，在推荐条件下储存并正确处理时，试剂盒可保持完整活性。 安全预防措施： 处理试剂前请阅读并理解 SDS （安全数据表）。首次发货时提供 SDS 的纸质版文件，此后可应要求提 供。 质控： Meridian 遵守 ISO 13485 质量管理体系运行。无甘油 T4 DNA 连接酶（ HC ）活性可使用 PCR 检测消化 后的 λDNA 的还原效率来测定。无甘油 T4 DNA 连接酶（ HC ）在放行前已经过纯度、核酸外切酶和核 酸内切酶污染测试。 注： 仅供科研和进一步生产使用。
T4 DNA连接酶
蛋白质的来源：带有克隆的T4 DNA连接酶基因的重组大肠杆菌菌株。单位定义：1个单位定义为将100 ng的DNA片段中的50％与粘性末端连接到50 µl 1x 1x DNA连接酶缓冲液后30分钟在23°C分子重量下孵育后所需的50％的DNA片段：55,292 DALTONS质量控制分析：使用2ffliutial serial dilitial doldutial doldiques soge。在1x DNA连接酶反应缓冲液中制作酶批次的稀释液，并添加到含有双束DNA片段和1X DNA连接酶反应缓冲液的20 µL反应中。在23°C下孵育30分钟，停止并在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上进行分析。蛋白浓度（OD 280）由OD 280吸光度确定。物理纯度，然后进行银色染色检测。通过比较浓缩样品中污染物带的聚集质量与稀释样品中蛋白蛋白蛋白带的质量来评估纯度。单链核酸酶在含有放射性标记的单链DNA底物的50 µL反应中确定，在37°C下孵育4小时4小时。双链外切核酸酶在50 µL反应中确定，该反应含有放射性标记的双链DNA底物和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。
T7 DNA连接酶
蛋白质的来源：一种带有克隆的T7 DNA连接酶基因的重组大肠杆菌菌株。单位定义：1个单位定义为在30分钟内在23°C下在30分钟内将100 ng DNA片段的50％结合的T7 DNA连接酶的量。分子量：41.1 kDa质量控制分析：使用2倍连续稀释方法测量单位活动。稀释液，并添加到含有双链DNA片段和1倍快速连接缓冲液的20 µL反应中。在23°C（室温）下孵育30分钟，浸在冰上，并在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上进行分析。蛋白浓度（OD 280）由OD 280吸光度确定。物理纯度，然后进行银色染色检测。通过比较浓缩样品中污染物带的聚集质量与稀释样品中蛋白蛋白蛋白带的质量来评估纯度。单链核酸酶在含有放射性标记的单链DNA底物的50 µL反应中确定，在37°C下孵育4小时4小时。双链外切核酸酶在50 µL反应中确定，该反应含有放射性标记的双链DNA底物和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。双链核酸内切酶在50 µL反应中确定，该反应含有0.5 µg质粒DNA和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。大肠杆菌16S rDNA的污染是使用5 µL r菌酸溶液的样品变性的样品，并在Taqman QPCR分析中筛选，以使用与16S rRNA locus相应的寡核苷酸引物，使用污染的大肠杆菌Genomic DNA。
T7 DNA连接酶
图6。使用Qiagen多路复用PCR加套件有效的19-PLEX PCR。使用Qiagen Multiplex PCR Plus套件的标准条件进行了19个目标（99-955 bp）的多重PCR，而无需进一步优化（QIAGEN）或使用供应商A II的各种热启动DNA聚合酶。使用琼脂糖凝胶进行分析。B分析使用Qiaxcel高级系统。Qiagen多路复用PCR加套件可导致所有目标的特定扩增，而无需优化。尽管使用不同的酶浓度进行了长时间的优化，但使用Supper A II的试剂盒的多重PCR也会导致片段缺失，即使使用较高的浓度也是如此。m：gelpilot 100 bp加梯子。
E3 连接酶分析与筛选
TR-FRET E3 检测涉及铽标记的 TUBE，其与由目标 E3 连接酶合成的荧光素标记的多泛素链结合。铽和荧光素是一对 FRET 对，因此含有荧光素标记的泛素的多泛素链在与铽-TUBE 结合时会产生 FRET 信号。该信号可以以均质、高通量的形式随时间监测，使其成为小分子筛选的理想选择。
限制性内切酶，（切割 DNA）（连接）连接酶...
这一现象最早是在 20 世纪 50 年代初 Salvador Luria 和 Giuseppe Bertani 实验室的工作中发现的。他们发现，一种噬菌体 λ 可以在大肠杆菌的一种菌株（例如大肠杆菌 C ）中生长良好，但当在另一种菌株（例如大肠杆菌 K ）中生长时，其产量会大幅下降。大肠杆菌 K 宿主细胞（称为限制性宿主）似乎能够降低噬菌体 λ 的生物活性。限制性酶 = 限制性内切酶
重组 DNA 连接酶 (lig)，部分
序列 MKYSELAGLY RRLEKTTLKT LKTRFVADFL KNVPDELLEI VPYLILGKVF PDWDERELGV GEKLLIKAVS IATGVPEGEI ENSIKDTGDL GESIALAVKK KKQKSFFSQP LTIKRVYDTF VKVAESQGEG SQDRKMKYLA NLFMDAQPEE AKYIARTVLG TMRTGVAEGI LRDAIAEAFK VKAELVERAY MLTSDFGYVT KVAKLEGNEG LSKVRIQVGK PVRPMLAQNA ASVKDALLEM GGEAAFEIKY DGARVQVHKD GDRVVIYSRR LENVTRSIPE IVEAVRSQLR PEKAIVEGEL VAVGDGGKPR PFQYVLRRFR RKYNIEEMIE RIPLELNLFD VLYVDGESLV DTPFMERRKR LEEAVEESER IKLAQQLVTK KAEEAEEFYR RALELGHEGL MAKRLDSVYE PGNRGKKWLK IKPTMEDLDL VIIGAEWGEG RRAHLLGSFL VAAYDQHRGE FVPVGKVGSG FTDEDLAEFT KMLKPLIVRE EGKYVEIEPR VVIQVTYQEI QKSPKYESGF ALRFPRYVAL REDKSPEEAD TIERISELYG LQERFKAKR
DNA连接酶4多态性对大肠癌的贡献
结直肠癌（CRC）约占所有新诊断的癌症病例的11％，并且是全球第三大癌症，导致与癌症相关的死亡人数第二高（1）。CRC的发病机理包括无数的因素，这些因素有助于复杂的遗传和表观遗传机制，最终导致正常结肠粘膜转化为恶性组织（2）。不足的DNA修复能力与基因组不稳定性和对癌症的敏感性增强密切相关（3-5）。此外，新兴的证据强调了DNA损伤反应，微卫星不稳定性状态与线粒体拷贝数和其他途径之间的遗传变异之间的强相关性，这是CRC患者的至关重要的决定因素（6-11）。
DNA连接酶III/LIG3单克隆抗体
背景信息DNA连接酶III（DNA连接酶3）是一种酶，在人类中被LIG3基因编码。人类Lig3基因编码依赖ATP的DNA连接酶，该连接酶密封双链DNA的磷酸二酯主链中的中断。真核生物中有三个依赖ATP的DNA连接酶。这些酶利用相同的三步反应机制； 1形成共价酶 - 腺苷酸中间体； 2将腺苷酸基的转移到DNA柱的5'磷酸末端； 3磷酸酯键的形成。与几乎所有真核生物中发现的Lig1和Lig4家族成员不同，Lig3家族成员的分布较差。LIG3基因通过替代翻译起始和替代剪接机制编码几种不同的DNA连接酶。
扭曲工程T4 DNA连接酶
拥挤的药物可在提高速度和效率的可选努力中使用了粘性拥挤剂，例如聚乙烯甘油（PEG），以增加底物的局部浓度并推动反应前进。但是，这种拥挤的代理可能会增加变异性或对于自动分配系统而言很难使用。此外，在克隆反应中使用拥挤剂需要在转换之前进行纯化步骤，这增加了动手的时间和处理。我们研究了在0％，2.5％和5％PEG 8000的情况下，各个连接酶对CFDNA底物的疗效。我们引用了电文件图的痕迹以识别3个连续的峰：底物，底物 + 1个适配器和底物 + 2个双侧适配器。如图5所示，扭曲工程的T4 DNA连接酶可以将大部分底物转换为所需的双连接峰独立于拥挤剂输入。