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DNA模板浓度对标准聚合酶链反应的原始研究文章效果Alif Haikal Mazlan 1，Muhamad Hafizal aqhmal M
Original Research Article Effect of DNA Template Concentration on Standard Polymerase Chain Reaction Alif Haikal Mazlan 1 , Muhamad Hafizal Aqhmal Muhamad Najib 1 , Mizaton Hazizul Hassan 1 , Fazleen Haslinda Mohd Hatta 1 , Rosmadi Mohd Yusoff 1* 1 Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM)雪兰莪分支，42300 Bandar Puncak Alam，雪兰莪，马来西亚摘要聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛使用的基本基本程序，用于扩大特定的脱氧核酸（DNA）序列。使用从人类血细胞中提取的DNA研究PCR的效率和特异性，在此优化过程中，使用了几种浓度的DNA模板来获得准确且可重现的结果。主要目标是确定哪种浓度是放大DNA靶序序的最佳浓度并研究浓度尺度对标准PCR的影响。在这项研究中，在优化的引物浓度，退火温度和延长时间的情况下，使用各种浓度的DNA模板进行了一系列PCR。结果表明，DNA模板浓度显着影响PCR的效率和特异性，因为在紫外线的琼脂糖凝胶电泳上增加了靶基因扩增带的强度，这表明PCR产物产物。随着DNA模板浓度降低导致非特异性扩增，引物二聚体的形成变得更加突出。从10 ng/µl到70 ng/µl的浓度是最佳反应，促成了靶基因扩增的显着壮举，而小于1 ng/µl的浓度却没有产生，而没有产生的非特异性结果，而无需留下少量的靶基因扩增。总而言之，我们的研究强调了DNA模板浓度的关键作用，优化了PCR，以提高可靠性和可重复性，从而扩展了我们对遗传分析，诊断和法医科学的理解。关键字：聚合酶链反应（PCR），DNA模板浓度，扩增效率和特异性 *相应的作者Rosmadi Mohd Yusoff Yusoff Pharmaceutical Life Sciences，药房，Teknologi Universiti Teknologi Mara（UITM）Mara（UITM）Selangor Branch，42300 Bandar Puncak puncak Alam，Malays selandia，Malays selangia，Malase。rosmadi0365@uitm.edu.my收到：2023年11月2日；接受：2024年1月3日在线上可用：2024年2月29日http：//doi.org/10.24191/ijpnacs.v7i1.01
基因组 DNA 对 PCR 的抑制
通常通过 PCR 对淋巴肿瘤中的微小残留病 (MRD) 进行灵敏的定量分析，使用免疫球蛋白或 T 细胞受体基因重排作为靶标，并使用患者或等位基因特异性寡核苷酸 (ASO) 作为引物。自 30 年前首次描述以来，ASO-qPCR 得到了广泛的应用，尤其是在欧洲，欧洲MRD 联盟成员发表的论文提供了有关该方法执行的指南和通用反向引物的推荐序列 [1-3]。如果候选患者特异性正向引物可以将 MRD 定量到 10 −4 的水平，则可以使用它，该引物的序列是患者独有的并且是特定于患者的。一些引物可以定量到 10 −4 以下，但有些会失败 [4]。失败有时可能是由于假阳性，但原因通常不清楚。 HAT-PCR（高 A/T PCR 或高退火温度 PCR）是 qPCR 的一种最新改进，其涉及引物设计和扩增条件的改进，以提高特异性并降低 MRD 检测中假阳性结果的频率 [5]。当检测 20 μg DNA 时，它的检测限为 10 −65 。在开发 HAT-PCR 之后，研究了根据欧洲 MRD 指南使用患者特异性正向引物和推荐的反向 J 引物进行的传统 qPCR 的灵敏度。单个引物对通常可以检测到低至 10 −4 的 MRD 水平，但经常无法检测到更低的水平。PCR 可以潜在地将单个靶标扩增到检测点 [6]，但靶标的扩增有时会被与基因组 DNA 同时纯化的外在物质或另一种内在扩增反应所抑制。引物二聚体扩增引起的抑制很常见，人们已对 PCR 进行了多项技术改进以尽量减少这种抑制 [ 7 , 8 ]。其他脱靶 DNA 序列的扩增反应也已被观察到 [ 9 ]，但此类反应的特征不甚了解，其重要性尚不清楚。传统 qPCR 无法将 MRD 定量低于 10 −4，这被证明是由于引物与基因组 DNA 相互作用造成的。除了有报道称碎片化的基因组 DNA [ 10 ] 可能会抑制 PCR 外，基因组 DNA 在 PCR 中的作用并未引起人们的兴趣。但是，我们认为分析这种现象很重要，原因有二。首先，了解和预防它可以提高 MRD 定量的灵敏度。其次，其他 PCR 检测需要在存在基因组 DNA 的情况下灵敏地检测靶标，因此可能容易受到抑制。因此，分析抑制及其预防机制可能与许多 PCR 检测的设计相关。