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利用 i-GONAD 进行多次连续基因组编辑和育种富集有助于生产转基因小鼠
摘要：转基因 (GM) 小鼠是生物医学研究中必不可少的工具。传统的转基因小鼠生成方法成本高昂，需要专门的人员和设备。使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 结合改进的输卵管核酸递送基因组编辑 (i-GONAD) 大大提高了在研究实验室中生产转基因小鼠的可行性。然而，由于 C57BL/6 (B6) 等近交系小鼠的生育能力低且胚胎脆弱，对其进行基因改造仍然具有挑战性。我们在尝试优化 i-GONAD 的同时，已在 B6 背景下成功生成了多种新型转基因小鼠品系。我们发现 i-GONAD 减少了超排卵怀孕雌性的产仔数，但不会影响怀孕率。自然交配或低激素剂量不会增加超排卵 B6 雌性中观察到的低生育率。然而，饮食丰富对怀孕成功有积极影响。我们还通过将接受 i-GONAD 治疗的怀孕 B6 雌性与同步怀孕的 FVB/NJ 伴母共同饲养来优化繁殖条件，以提高幼崽的存活率。因此，通过丰富的饮食和与生育能力强的雌性（如 FVB/NJ）共同抚养幼崽，增加了转基因小鼠的产生。在本研究中，我们使用 CRISPR/Cas 系统同时或连续靶向单个和多个基因座，产生了 16 只转基因小鼠。我们还比较了使用不同方法插入 LoxP 以产生条件性敲除小鼠的同源定向修复效率。我们发现，两步连续 LoxP 插入（其中每个 LoxP 序列在不同的 i-GONAD 程序中单独插入）是一种低风险、高效的产生 floxed 小鼠的方法。
Oct4、Sox2、Klf4、c-My（OSKM）基因治疗...
雌二醇 [4, 5]。我们小组实施了能够延长雌性大鼠生殖功能的策略。因此，在雌性 MA 大鼠中，我们之前已经证明，从 8 月龄开始对下丘脑内胰岛素样生长因子-I (IGF-I) 进行基因治疗，可将动物的规律性周期延长至 10 个月以上（MA 大鼠停止排卵的年龄），并保持卵巢结构的完整性。在 11 月龄时，接受治疗的大鼠通常表现出保留其规律性的周期性以及正常的卵巢组织学，而对照组在相同年龄时大多无周期性，并且表现出高比例的多囊卵巢和少量黄体 [6]。衰老与表观遗传学动物克隆的发现 [7, 8] 和随后细胞重编程的发展
利用 CRISPR/Cas9 诱变技术对性信息素的生物合成进行调控，导致甜菜夜蛾（一种害虫）失去雌性吸引力
已知处女雌蛾会释放性信息素来吸引同类雄性。准确的性信息素是它们进行化学交流的必要条件。鳞翅目昆虫甜菜夜蛾的性信息素含有在第12个碳位置上有双键的不饱和脂肪酸衍生物。甜菜夜蛾的去饱和酶 ( SexiDES5 ) 被认为具有双重功能，它通过在第11和12个碳上形成双键来合成Z9,E12-十四碳二烯酸，该酸可乙酰化为主要的性信息素成分Z9,E12-十四碳烯酸乙酸酯 ( Z9E12-14:Ac )。利用 CRISPR/Cas9 构建了 SexiDES5 的缺失体，并进行近交繁殖以获得纯合子。突变雌蛾不能产生Z9E12-14:Ac以及Z9-14:Ac和Z11-14:Ac。突变雌蛾的信息素提取物也不能在雄蛾触角中诱发感觉信号。它们也不能诱导雄蛾的交配行为，包括毛笔竖立和定向。在田间，这些突变雌蛾不能吸引任何雄蛾，而对照雌蛾可以吸引雄蛾。这些结果表明SexiDES5能够催化第11和12位上的去饱和作用，从而产生S . exigua的性信息素成分。这项研究还表明，通过产生没有吸引力雌蛾，基因组编辑技术可以应用于害虫防治。
非基因驱动转基因雄性蚊子
雄性蚊子具有生育能力，因此可以交配并产生可存活的后代。这种蚊子经过基因改造后主要产生雄性后代（实验室中高达 95%）。雄性蚊子不会叮咬，因此不会传播疾病。由于这种蚊子不携带基因驱动技术（50% 的后代通过正常遗传携带转基因），在获得批准的野外释放中，这种基因改造只会传递有限的几代，然后就会从种群中消失，大概在两个雨季内。雄性蚊子具有父系遗传性，这意味着携带基因改造的雄性会生出大多数雄性后代，而与未携带基因改造的雄性交配的雌性会拥有 50% 雌性和 50% 雄性的正常性别比例。
用于人工授精的性别控制精液
发情检测：受精后，性别决定的精子细胞通常在雌性生殖道中保持较短的生育期。因此，使用性别决定的精液进行人工授精应在接近排卵时间时进行。牛站立发情的时间长短变化很大；然而，排卵发生在站立发情行为开始后约 30 小时。因此，为了使用性别决定的精液实现最佳怀孕率，表达站立发情的雌性应在其站立发情行为开始后约 18 至 24 小时接受人工授精。请注意，这比使用常规精液进行人工授精的推荐时间晚。为了准确起见，强烈建议使用发情检测辅助工具并每天至少监测三次发情活动（例如黎明、中午和黄昏）。
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繁殖季节相当广泛，从八月到三月，已经以公平的数量获得了鸡蛋。成熟的男性和女性的身材相当大，长度为12英寸或更大。从晚上在早期收集的早期面包中进行判断，很可能是当时发生的卵子。将鸡蛋放在粘液一起放置的一堆。当雌性挤出鸡蛋时，它们会被大量覆盖，圆形的球体，颜色浅淡黄色绿色，类似于葡萄和10至10.5毫米。直径（图。1和2）。他们被束缚在一起一段时间，几个小时后可能由于水的作用而分开。雌性14英寸的成熟卵巢包含50个发达的OVA和大量的未成熟卵子，尺寸为1.5至2 mm。直径非常透明。成熟鸡蛋周围的膜非常厚，约为1毫米。厚度。
经基因证实，这是两种截然不同的古老蛇类——阿斯特里克斯 (Natrix astreptophora) 和毛拉蛇 (N. maura) 的杂交品种
利用两个线粒体 DNA 片段和六个核基因，我们确认了在西班牙西南部安达卢西亚（韦尔瓦市）捕获的一条形态中间的蛇，是雌性 Natrix astreptophora 和雄性 N. maura 的 F1 杂交种。这两个亲本物种在 2150 万年前分化，这就是它们的杂交能力惊人的原因。由于 N. astreptophora 的稀有性和西班牙西南部 N. maura 的数量丰富，使得 N. astreptophora 雌性很难找到同种雄性，因此促成了种间交配。面对之前发表的 N. astreptophora 和 N. maura 之间古老基因流动的基因组特征，我们的发现提出了一个问题：偶尔的杂交是否仍有助于这两个深度分化的古老类群之间持续交换遗传信息。