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基于 CRISPR/Cas9 的多拷贝整合系统用于黑曲霉中的蛋白质生产
丝状真菌黑曲霉因其高蛋白质分泌能力而闻名，是同源和异源蛋白质生产的首选宿主。为了进一步提高黑曲霉的蛋白质生产能力，我们制备了一组专用的蛋白质生产菌株，其在基因组的预定位置包含多达 10 个葡糖淀粉酶着陆位点 (GLS)。这些 GLS 取代了编码大量存在或编码不需要的功能的酶的基因。每个 GLS 都包含葡糖淀粉酶基因 (glaA) 的启动子和终止子区域，该基因是黑曲霉中表达最高的基因之一。整合多个基因拷贝（通常通过随机整合实现）可提高蛋白质产量。在我们的方法中，GLS 允许使用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑快速进行靶向基因替换。通过在每个 GLS 中引入相同或不同的独特 DNA 序列（称为 KORE 序列）并设计 Cas9 兼容的单向导 RNA，人们能够选择目标基因在哪个 GLS 整合。通过这种方式，可以轻松快速地制备一组具有不同目的基因拷贝数的相同菌株，以比较蛋白质生产水平。为了说明其潜力，我们成功地利用表达平台生成多拷贝 A. niger 菌株，该菌株产生 Penicillium expansum PatE::6xHis 蛋白，催化棒曲霉素生物合成的最后一步。表达 10 个拷贝 patE::6xHis 表达盒的 A. niger 菌株在培养基中产生约 70 lg mL 1 PatE 蛋白，纯度略低于 90%。
揭示土曲霉中潜在的葡萄糖苷酶抑制剂的分子方面：分子对接耦合动力学模拟和药代动力学分析的计算之旅
1 阿卜杜勒阿齐兹国王大学药学院天然产物系，吉达 21589，沙特阿拉伯；nhamadaelshoubaki@stu.kau.edu.sa（NMA）；melfaky@kau.edu.sa（MAE）；aekoshak@kau.edu.sa（AEK）2 阿卜杜勒阿齐兹国王大学精准医学人工智能中心，吉达 21589，沙特阿拉伯 3 阿卜杜勒阿齐兹国王大学药学院药物化学系，吉达 21589，沙特阿拉伯；maaalharbi1@kau.edu.sa 4 加拉拉大学药学院生药学系，新加拉拉 43713，埃及； reda.fouad@gu.edu.eg 5 苏伊士运河大学药学院生药学系，埃及伊斯梅利亚 41522 6 苏伊士运河大学药学院药物化学系，埃及伊斯梅利亚 41522 * 通讯地址：ssahmed@kau.edu.sa (SSE)；khaled_darwish@pharm.suez.edu.eg (KMD)；电话：+966-544-512-552 (SSE)；+20-100-5330-114 (KMD)
利用 CRISPR-Cas9 和体外组装的核糖核蛋白操纵全局调节器 mcrA 上调温曲霉中的次级代谢产物
摘要：丝状真菌基因组测序表明，大多数次级代谢物生物合成基因簇 (BGC) 在标准实验室条件下处于沉默状态。在这项研究中，我们在温氏曲霉中建立了一个体外 CRISPR-Cas9 系统。为了激活原本沉默的 BGC，我们删除了负转录调节因子 mcrA 。当菌株在马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 上培养时，mcrA (mcrA Δ) 的缺失导致总共产生 17 种 SM。在 15 种 SM 中，有 9 种已得到充分表征，包括大黄素 ( 1 )、大黄酸乙酯 ( 2 )、sulochrin ( 3 )、大黄酸乙酯二蒽酮 ( 4 )、14- O-脱甲基sulochrin ( 5 )、( 反式 / 顺式 )-大黄素二蒽酮 ( 6 和 7 ) 和 ( 反式 / 顺式 )-大黄素大黄酸乙酯二蒽酮 ( 8 和 9 )。经发现，这些化合物均由相同的聚酮合酶 (PKS) BGC 产生。随后，我们在 mcrA Δ 背景下针对该 PKS 簇进行了二次敲除。双敲除菌株的代谢物谱揭示了先前未在 mcrA Δ 亲本菌株中检测到的新代谢物。从双敲除菌株中纯化出另外两种 SM，并被鉴定为曲霉酸 B ( 16 ) 和一种结构相关但之前未鉴定的化合物 ( 17 )。这项工作首次提出了一种能够在 A.wentii 中进行靶向基因编辑的简便遗传系统。这项工作还说明了进行双敲除以消除主要代谢产物的实用性，从而能够发现更多的 SM。■ 简介
环化酶基因参与炭黑曲霉中赭曲霉毒素 A 生物合成的证据
摘要：赭曲霉毒素 A (OTA) 是一种众所周知的霉菌毒素，广泛分布于食品和饲料中。真菌基因组测序对于识别已知和新化合物的次级代谢物基因簇非常有用。对 A. steynii、A. westerdijkiae、A. niger、A. carbonarius 和 P. nordicum 中 OTA 生物合成簇的比较分析表明，在五个结构基因 (otaA、otaB、ota、otaR1 和 otaD) 中，OTA 簇的组织具有高度的同源性。此外，最近对黑曲霉 OTA 产生菌进行的详细比较基因组分析发现了一个环化酶基因 otaY，它位于 otaA 和 otaB 基因之间的 OTA 簇中，编码的预测蛋白质与 SnoaL 的结构域高度相似。这些蛋白质已被证明能催化链霉菌中产生的聚酮抗生素生物合成中的闭环步骤。在本研究中，我们证明了在 OTA 允许条件下 A. carbonarius 中环化酶基因的上调，这与其他 OTA 簇基因的表达趋势及其在 OTA 生物合成中的作用一致，即通过完全基因缺失。我们的研究结果首次指出了环化酶基因参与了 OTA 生物合成途径。它们代表着对 A. carbonarius 中 OTA 生物合成分子基础的理解向前迈出了一步。
基因组编辑技术及其在工业丝状真菌曲霉中的应用潜力
摘要：Aspergillus oryzae是一种浮雕的真菌，已用于传统的日本酿酒行业，例如清酒，酱油和味o味生产。此外，绿曲霉已被用于异源蛋白质的产生中，并且该真菌由于能够通过引入外国生物合成基因而产生大量异源天然产物，因此该真菌最近被用于生物合成研究。遗传操作在绿曲霉的功能发展中很重要，主要限于野生应变rib40，这是一种适用于实验室分析的基因组参考。但是，有许多具有各种专业特征的A. oryzae的工业酿造菌株，并且根据各种目的所需的特性选择性地使用它们，例如清酒，酱油和味o的生产。自2000年代初以来，已经开发了基因组编辑技术；在这些技术中，转录激活效应效应子核酸酶（Talens）和定期插入的短期短质体重复序列/CRISPR-相关蛋白9（CRISPR/CAS9）已应用于A. oryzae的基因修饰。值得注意的是，CRISPR/CAS9系统已经显着提高了A. oryzae工业菌株基因修饰的效率。在这篇综述中，总结了基因组编辑技术及其在A. Oryzae中的应用潜力的发展。
利用比较基因组学鉴定黑曲霉中的新型生物合成基因簇
摘要：之前，DNA 微阵列分析表明，在与枯草芽孢杆菌共培养中，锚定在黑曲霉非核糖体肽合成酶上的生物合成基因簇被下调。基于系统发育和同源性分析，我们发现这个基因簇 NRRL3_00036-NRRL3_00042 包含预测编码非核糖体肽合成酶、含 FAD 结合结构域的蛋白质、未知蛋白质、转运蛋白、细胞色素 P450 蛋白、含 NAD(P) 结合结构域的蛋白质和转录因子的基因。我们过表达了簇内转录因子基因 NRRL3_00042 。过表达菌株 NRRL3_00042 OE 表现出生长速度降低和黄色色素产生减少，质谱分析显示黄色色素对应于两种化合物，质量分别为 409.1384 和 425.1331。我们删除了 NRRL3_00042 OE 菌株中编码 NRRL3_00036 非核糖体肽合成酶的基因。所得菌株恢复为野生型表型。这些结果表明，由 NRRL3_00036 非核糖体肽合成酶基因锚定的生物合成基因簇受簇内转录调控基因 NRRL3_00042 调控，并且它参与了两种以前未表征的化合物的生产。