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细胞锌状态改变染色质的可及性和p53与DNA
非典型的霉菌/色肽肿瘤（AT/RTS）是小儿脑肿瘤以其侵略性和异常但仍未解决的表观遗传性调节而闻名。为了更好地理解其恶性肿瘤，我们研究了AT/RT特异性DNA高甲基化与基因表达和转录因子结合改变以及如何与上游调节相关的如何相关。髓母细胞瘤，脉络丛肿瘤，pluripotent干细胞和胎儿脑被用作参考。神经转录调节剂对基因组区域的一部分，与多能干细胞相似，在/RTS中与多能干细胞相似并在胎儿脑中脱甲基化。at/rt-unique DNA高甲基化与抑制性复合物2相关，并与抑制基因相关，在神经发育和肿瘤发生中作用。通过抑制其靶位点的抑制表达或DNA高甲基化损害了几种无法与甲基化DNA结合的几种神经/神经性先驱因子的活性，该活性也受到了靶位位点的抑制作用，这也经过实验性地验证了在甲状腺囊泡瘤和/RT样品中为NeuroD1验证的NeuroD1。这些结果突出显示并表征了DNA高甲基化在AT/rt malignancy和停止神经细胞分化中的作用。
舒尼替尼和紫檀芪联合治疗通过抑制 PDZD8 对胃癌发挥抗肿瘤作用
摘要：分子靶向药物在胃癌治疗中的应用日益广泛，但胃癌中分子靶向药物的种类仍然有限，需要开发新的分子靶向治疗方法。在体内和体外研究了舒尼替尼（SUN）与紫杉醇（PTE）联合对人胃癌细胞系TMK1和MKN74的影响。与单独使用SUN或PTE治疗相比，联合治疗可显著抑制细胞增殖，并显著增加氧化应激。SUN与线粒体Fe 2+的显著滞留有关。SUN处理的细胞降低了PDZ结构域蛋白8（PDZD8）的表达。敲低两种细胞中的 PDZD8 均诱导 Fe 2+ 滞留，siPDZD8+PTE 显著抑制细胞增殖，抑制氧化磷酸化，SUN+PTE 组合亦是如此。在裸鼠肿瘤模型中，与单独使用 SUN 相比，SUN+PTE 治疗具有明显的抗肿瘤作用。PDZD8 可能是新发现的 SUN 脱靶位点，PTE 与 SUN 联合使用可显著增强胃癌细胞系的抗肿瘤活性。SUN 与 PTE 联合使用可能成为胃癌的一种新的分子靶向治疗方法。
cas9兔子mab
CRISPR相关蛋白9（CAS9）是RNA引导的DNA核酸酶，是Pyogenes链球菌CRIS-CRISPR-antivirAniviral免疫系统的组成部分，可提供针对外肌小体遗传材料的适应性免疫。CRISPR抗病毒作用的机制涉及三个步骤：（i）宿主细菌获取外国DNA； （ii）CRISPR RNA（CRRNA）的合成和成熟，然后形成RNA-CAS核酸酶 - 蛋白质复合物； （iii）通过宿主细菌获取外源DNA；该络合物识别出外源DNA，并通过CAS核酸酶活性通过裂解而定向干扰。II型CRISPR/CAS抗病毒免疫系统为精确的基因组编辑提供了强大的工具，并具有特定调节基因和治疗应用的潜力。必须在细胞中引入或表达CAS9蛋白和引导RNA（包括CRRNA和反式激活CRRNA（tracroRNA）之间的融合）。导向RNA的5'末端的20个核苷酸序列将Cas9引导到特定的DNA靶位点。因此，可以“编程” Cas9以在体外以及细胞和生物中切割各种DNA位点。CRISPR/CAS9基因组编辑工具已用于包括小鼠和人类细胞在内的许多生物中。研究表明，CRISPR可用于在啮齿动物和灵长类动物胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因。
通过 CRISPR RNA 支架同时进行多功能转录组工程。
RNA 加工和代谢在细胞内受到精确调控，以确保 RNA 的完整性和功能。尽管随着 CRISPR-Cas13 系统的发现和改造，靶向 RNA 工程已成为可能，但同时调节不同的 RNA 加工步骤仍然无法实现。此外，与 dCas13 融合的效应物导致的脱靶事件限制了其应用。在这里，我们开发了一个新平台，通过 S 支架标记的 gRNA 进行组合 RNA 工程 (CREST)，它可以同时对不同的 RNA 靶标执行多种 RNA 调节功能。在 CREST 中，RNA 支架附加到 Cas13 gRNA 的 3' 端，其同源 RNA 结合蛋白与酶结构域融合以进行操作。以 RNA 可变剪接、A 到 G 和 C 到 U 碱基编辑为例，我们开发了双功能和三功能 CREST 系统，用于同时进行 RNA 操作。此外，通过将 ADAR2 脱氨酶结构域的两个分裂片段分别与 dCas13 和/或 PUFc 融合，我们重建了其在靶位点的酶活性。这种分裂设计可以减少近 99% 的脱靶事件，而这些事件通常是由全长效应物引起的。CREST 框架的灵活性将丰富用于研究 RNA 生物学的转录组工程工具箱。
靶向 CRISPR/Cas9 活动可能导致非设计性的......
摘要：基于成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 方法的出现极大地影响了基因组工程。该方法最初被发现为原核生物的适应性免疫系统，在过去十年中发展迅速，克服了多项技术挑战和科学任务，成为精确基因组操作最有效、最可靠、最易于使用的技术之一。尽管 CRISPR/Cas9 技术具有毋庸置疑的优势，但它无法确保基因组编辑结果的绝对准确性和可预测性。主要问题之一（尤其是对于临床应用而言）是由 CRISPR/Cas9 诱导的双链 DNA 断裂的易错修复导致的突变。在某些情况下，这种易错修复可能导致 CRISPR/Cas9 靶位点内发生不可预测和计划外的大规模基因组修饰。本文描述了我们所知的最大的非设计靶向缺失，大小约为 293 kb，该缺失发生在将 CRISPR / Cas9 系统组件注射到小鼠受精卵的细胞质中后，并推测了其起源。我们推测该缺失是由于修复过程中双链断裂的一端被截断而发生的。
![植物生物技术 23.0611a (2023) [adv.pub.]](/simg/8\886d12a05c6e0ea5545c8dfe272b81f8a9782723.webp)
植物生物技术 23.0611a (2023) [adv.pub.]
摘要 马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 具有四倍体基因组。要制造缺乏特定基因功能的突变体，必须将突变引入所有四个基因等位基因中。为了实现这一目标，我们开发了一种强大的基因组编辑工具 CRISPR/dMac3-Cas9，它安装了翻译增强子 dMac3，大大增加了下游开放阅读框的翻译。采用三种向导 RNA (gRNA) 的 CRISPR/dMac3-Cas9 系统大大提高了突变的发生率。该系统能够创建颗粒结合淀粉合酶 (GBSS) 和淀粉分支酶 (SBE) 的 4 等位基因突变体。这些突变体显示出功能缺陷的特征，表明我们成功地对马铃薯四倍体基因组进行了有效的基因组编辑。在这里，我们展示了使用 GBSS1 基因突变体时 gRNA 数量对目标基因有效诱变的影响。采用三个 gRNA 基因的 CRISPR/dMac3-Cas9 比采用两个 gRNA 的 CRISPR/dMac3-Cas9 实现了更高的突变效率，表明突变效率受靶区域 gRNA 数量的剂量效应影响。SBE3 基因的等位基因含有导致 gRNA 序列差异的 SNP，但这些 gRNA 有效发挥作用。然而，诱导了许多重排事件和大量缺失。这些结果支持 gRNA 与靶序列准确结合的重要性，这可能为避免脱靶位点的意外突变提供线索。
Slr1-d7 和 ... 的生成和转录组分析
摘要：水稻SLR1基因编码DELLA蛋白（具有DELLA氨基酸基序的蛋白质），其功能丧失突变通过抑制植物生长而使植物矮化。我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在水稻中靶向突变DELLA/TVHYNP结构域，生成具有半显性矮化表型的slr1-d突变体。在31株转基因植株中获得了16个遗传编辑株系。深度测序结果表明，突变体在SLR1基因的TVHYNP结构域靶位点有6种不同的突变类型。同源编辑植株在T1代中选择了没有通过分离转录的T-DNA（T-DNA）的个体。slr1-d7和slr1-d8植株导致对赤霉素（GA）不敏感的矮化表型，叶片皱缩，节间缩短。通过 RNA-seq 进行的全基因组基因表达分析表明，在编辑的突变体植物中，两个与 GA 相关的基因 GA 20 OX 2（赤霉素氧化酶）和 GA 3 OX 2 的表达水平有所增加，这表明 GA 20 OX 2 充当了 GA 12 信号的转换器。这些突变体植物需要改变 GA 反应，至少部分是由于植物激素信号系统过程的缺陷，并阻止了细胞伸长。新的突变体，即 slr1-d7 和 slr1-d8 系，是有价值的半显性矮化等位基因，具有利用 CRISPR / Cas9 系统在水稻中进行分子育种的潜在应用价值。
通过 DNA 甲基化编辑人工逃离 XCI......
大量 X 连锁基因逃避 X 染色体失活，并与独特的表观遗传特征相关。与 X 逃避密切相关的一种表观遗传修饰是启动子区域的 DNA 甲基化降低。在这里，我们通过编辑 CDKL5 启动子上的 DNA 甲基化，从人类类神经元细胞中沉默的 X 染色体等位基因中创建了一种人工逃避，CDKL5 是一种导致婴儿癫痫的基因。我们发现，使用三个向导 RNA 将 TET1 的催化域与靶向 CDKL5 启动子的 dCas9 融合，结合从 CpG 二核苷酸中去除甲基，可显著重新激活失活等位基因。令人惊讶的是，我们证明 TET1 和 VP64 转录激活因子的共表达对非活性等位基因的重新激活具有协同作用，使活性等位基因的水平超过 60%。我们进一步使用多组学评估来确定转录组和甲基化组上的潜在脱靶。我们发现 dCas9 效应物的协同传递对靶位点具有高度选择性。我们的研究结果进一步阐明了与逃避 X 染色体失活相关的 DNA 甲基化降低的因果作用。了解与逃避 X 染色体失活相关的表观遗传学对患有 X 连锁疾病的人有很大的帮助。
通过对 CDKL5 基因进行 DNA 甲基化编辑，人工逃避 XCI
大量 X 连锁基因逃避 X 染色体失活，并与独特的表观遗传特征相关。与 X 逃避密切相关的一种表观遗传修饰是启动子区域的 DNA 甲基化降低。在这里，我们通过编辑 CDKL5 启动子上的 DNA 甲基化，从人类类神经元细胞中沉默的 X 染色体等位基因中创建了一种人工逃避，CDKL5 是一种导致婴儿癫痫的基因。我们发现，使用三个向导 RNA 将 TET1 的催化域与靶向 CDKL5 启动子的 dCas9 融合，结合从 CpG 二核苷酸中去除甲基，可显著重新激活失活等位基因。令人惊讶的是，我们证明 TET1 和 VP64 转录激活因子的共表达对非活性等位基因的重新激活具有协同作用，使活性等位基因的水平超过 60%。我们进一步使用多组学评估来确定转录组和甲基化组上的潜在脱靶。我们发现 dCas9 效应物的协同传递对靶位点具有高度选择性。我们的研究结果进一步阐明了与逃避 X 染色体失活相关的 DNA 甲基化降低的因果作用。了解与逃避 X 染色体失活相关的表观遗传学对患有 X 连锁疾病的人有很大的帮助。
H19/ 位点的基因座特异性和稳定 DNA 去甲基化...
摘要：DNA 甲基化与染色质状态和细胞类型特异性基因表达的调节密切相关。印记控制区 (ICR) 上的等位基因特异性 DNA 甲基化调控母源或父源等位基因的印记基因的独家表达。H19/IGF2 印记位点 ICR1 处的异常 DNA 高甲基化或低甲基化分别是印记障碍 Beckwith-Wiedemann 综合征 (BWS) 和 Silver-Russell 综合征 (SRS) 的特征。在本文中，我们使用 dCas9-SunTag 和 TET1 催化域进行表观基因组编辑，以诱导 HEK293 细胞中 ICR1 处的靶向 DNA 去甲基化。靶位点的 5-甲基胞嘧啶 (5mC) 水平降低高达 90%，瞬时转染 27 天后，仍观察到 >60% 的去甲基化。与 ICR1 内 CTCF 结合位点的稳定去甲基化一致，DNA 甲基化敏感绝缘体 CTCF 蛋白的占有率在 27 天内增加了 2 倍以上。此外，H19 表达稳定增加了 2 倍，而 IGF2 受到抑制，尽管只是暂时的。我们的数据表明，表观基因组编辑能够在一次短暂治疗后实现印迹控制区域 DNA 甲基化的长期变化，这可能为治疗性表观基因组编辑方法在治疗印迹障碍方面铺平了道路。