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CRISPR-Cas 系统是原核生物的一种免疫机制，可特异性识别和降解外源核酸，从基因上保护生物体 [1]。CRISPR-Cas 系统的功能分为用于靶核酸识别的向导 RNA (gRNA) 和用于切割的 Cas 核酸酶 [1]。该模块化系统通过修改 gRNA 上的靶标识别序列 (TRS) 来切割所需的核苷酸序列 [2]，从而实现跨各种生物体（包括微生物）的基因组编辑 [3, 4]。第 2 类 CRISPR-Cas 系统具有单个效应蛋白，主要用于基因组编辑。值得注意的是，大量研究集中在源自化脓性链球菌 (SpCas9) 的 Cas9 [5]。然而，Cas9 蛋白的异源表达可能导致细胞毒性或异常生长 [6, 7]。因此，内源性 CRISPR-Cas 系统 [8]、Cas9 直系同源物 [9] 和 Cas12 或 Cas13 [10] 被用作编辑工具，以提供与靶细胞更好的兼容性。此外，广泛使用的 SpCas9 的尺寸较大（4.1 kb；1,368 aa），这带来了挑战，特别是在包装到空间有限的病毒载体中时 [11]。微型 CRISPR-Cas12f1 系统因其解决这一挑战的潜力而备受关注。Cas12f1 直系同源物由约 500 aa 的单个多肽组成，这比 Cas9 的长度短得多 [12]。已知 Cas12f1 核酸酶形成二聚体，每个单个 RuvC 结构域切割靶 DNA 的两条链 [13, 14]。 Cas12f1 核酸酶在基因组中用于单基因编辑已被报道在多种生物体中，包括大肠杆菌 [15, 16]、炭疽芽孢杆菌 [17]、肺炎克雷伯菌 [18]、小鼠 [19] 和人类 [20, 21]。最近，在天蓝色链霉菌中证实了 Cas12f1 介导的两个基因同时缺失 [22]。然而，Cas12f1 在精确的多重基因组编辑中的应用尚未有记录。在本研究中，我们尝试使用 CRISPR-Cas12f1 系统在大肠杆菌中进行单核苷酸水平的多重基因组编辑。采用了两种策略——调节细胞恢复温度和修改 gRNA，并评估了它们对多重基因组编辑效率和准确性的影响。
通过低温恢复实现高效的 CRISPR-Cas12f1 介导的多重细菌基因组编辑
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