机构名称：
¥ 1.0
协议＃：PI具有38年的尿素发育性大肠杆菌和其他BSL-2细菌物种的经验。过去，PI遵循了有关BSL-2生物安全预防措施的NIH指南。PI使用BSL-2细菌进行了38年的分子操作经验。重组质粒的构建用于创建大肠杆菌重组质粒，毒力因子基因将在4014 PSSC中的大肠杆菌菌株NU149或UTI89 DNA中放大PCR。每种PCR产物的设计将具有限制性核酸内切酶位点，将DNA侧翼的固定在PPP2-6，PCRISPPATHBRICK或PMMB91中。将使用适当的限制性核酸内切酶切割DNA，并与质粒DNA连接，还可以用适当的限制性核酸内切酶切割。连接的DNA将转化为大肠杆菌DH5α细胞，为PPP2-6和PCRISPPHATHBRICK质粒选择PMMB91质粒或氯霉素的氨苄西林抗性。含有正确的毒力因子基因的转化子将通过限制性核酸内切酶消化验证。验证后，将纯化的质粒DNA被电穿孔到大肠杆菌NU149或UTI89中。电穿孔比色杯可单一使用，并将其放入高压釜袋中。菌落将在含有氯霉素或氨苄青霉素的Luria琼脂板（LA）板上选择。使用后，板将被丢入高压釜袋中，用于使用高压灭菌。先前的研究表明，大肠杆菌可以自然对氯霉素和氨苄青霉素产生抗性。
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