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World File Search System寡脱氧
哺乳动物细胞中的耦合基因编辑
通过转染短单链寡脱氧核糖核苷酸（SSODN），可以将小基因组改变引入高精度的哺乳动物细胞中。ssodns在DNA复制过程中集成到基因组中，但是由DNA不匹配修复（MMR）易于检测所得的杂化，从而阻止了有效的基因修饰。我们以前已经证明，当Ssodn中的核苷酸不匹配是锁定的核酸（LNA）时，可以避免MMR的抑制作用。在这里，我们揭示了LNA修饰的SSODN（LMOS）并未作为哺乳动物细胞中的完整实体整合，而是在靶杂交之前和之后被严重截断。我们发现，LMO的5'-arm臂中的单个额外（非LNA修饰）突变影响靶向效率，并激活了MMR途径。相比之下，3'-ARM中的其他突变不会影响靶向效率，并且不受MMR的影响。甚至更引人注目的是，3'-arr中的同源性在很大程度上是有效靶向的，暗示了大量的3'末端修剪。我们提出了一个在包括LMO降解的哺乳动物细胞中LMO指导基因修饰的精制模型。
连接辅助同源重组通过部署 MMEJ 和 HDR 实现精确的基因组编辑
CRISPR / Cas12a 是一种单效应核酸酶，与 CRISPR / Cas9 一样，由于其能够产生靶向 DNA 双链断裂 (DSB) 而被用于基因组编辑。与 Cas9 产生的平端 DSB 不同，Cas12a 产生的粘性末端 DSB 可能有助于精确的基因组编辑，但这一独特功能迄今为止尚未得到充分利用。在当前的研究中，我们发现，短双链 DNA (dsDNA) 修复模板包含一个与 Cas12a 产生的 DSB 末端之一匹配的粘性末端和一个与 DSB 另一端相邻的基因组区域具有同源性的同源臂，能够精确修复 DSB 并引入所需的核苷酸替换。我们将这种策略称为“连接辅助同源重组”(LAHR)。与单链寡脱氧核糖核苷酸 (ssODN) 介导的同源定向修复 (HDR) 相比，LAHR 的编辑效率相对较高，这在报告基因和内源基因中均有体现。我们发现 HDR 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 机制都参与了 LAHR 过程。我们的 LAHR 基因组编辑策略扩展了基因组编辑技术的范围，并更广泛地了解了基因组编辑中涉及的 DNA 修复机制的类型和作用。