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利用基因打靶和主要编辑对植物进行精准基因组编辑：现有和新兴策略
精确修改植物基因组（例如在预定位点无缝插入、删除或替换 DNA 序列）是一项具有挑战性的任务。基因靶向和主要编辑是目前实现此目的的最佳方法。然而，这些技术在植物中效率低下，这限制了它们在作物育种计划中的应用。最近，人们取得了重大进展，以提高这些技术在植物中的效率。RNA 供体模板、化学修饰的供体 DNA 模板和串联重复同源定向修复等几种策略旨在改善基因靶向。此外，改进的主要编辑 gRNA 设计、使用工程逆转录酶和分裂主要编辑组件提高了植物中主要编辑的效率。本文回顾了这些新兴策略和现有技术，并对其未来改进和开发强大的植物精确基因组编辑技术进行了各种展望。关键词：CRISPR/Cas、精确基因组编辑、基因靶向、主要编辑、植物
通过基因打靶和随后的单链退火介导的标记基因切除，在植物中对 miRNA 靶位进行精确的基因组编辑
基因打靶 (GT) 能够使用供体 DNA 作为模板进行精确的基因组修饰（例如，引入碱基替换）。结合用于选择 GT 细胞的选择标记的干净切除，GT 有望成为一种标准的、普遍适用的碱基编辑系统。之前，我们展示了通过 piggyBac 转座子从水稻中 GT 修饰的位点进行标记切除。然而，piggyBac 介导的标记切除的局限性在于它只能识别 TTAA 序列。最近，我们提出了一种新颖的通用精确基因组编辑系统，该系统由 GT 和随后的单链退火 (SSA) 介导的标记切除组成，原则上不受靶序列的限制。在本研究中，我们将碱基替换引入了 OsCly1 基因的 microRNA miR172 靶位点，OsCly1 基因是参与闭花授粉开花的大麦 Cleistogamy1 基因的直系同源物。为确保有效的 SSA，GT 载体在选择标记的两端都含有 1.2 kb 的重叠序列。使用带有重叠序列的载体进行正负选择介导的 GT 的频率与使用不带重叠序列的 piggyBac 介导的标记切除载体的频率相当，在 T 0 代中，SSA 介导的标记切除频率计算为 ∼ 40%。这个频率被认为足以产生无标记细胞，尽管它低于使用 piggyBac 介导的标记切除的频率（接近 100%）。到目前为止，使用碱基编辑器和基于 CRISPR/Cas9 的 prime 编辑系统在目标基因的不连续多个碱基中引入精确替换已经相当困难。在这里，利用 GT 和我们的 SSA 介导的标记切除系统，我们成功地在 OsCly1 基因的 miR172 靶位点上不仅实现了单个碱基的精确替换，而且还实现了人工不连续的多个碱基的精确替换。