XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System敲入
使用 dCas9-SSAP 编辑器进行长序列基因组敲入的分步方案
请参阅相关出版物和图 2 了解模板设计示例。我们建议使用在插入/替换序列（模板的编辑部分）两端至少有 200bp 同源臂的 dsDNA 模板。我们建议将模板克隆到简单的质粒中
利用内源性修复机制实现牛胚胎的靶向基因敲入
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2020 年 6 月 12 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.06.09.143115 doi：bioRxiv preprint
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
表征 CRISPR 敲入细胞中内源性 Claudin-1 的表达、运动性和对丙型肝炎病毒的易感性。
1 法国国家科学研究院、IRIM 蒙彼利埃传染病研究所，34293 蒙彼利埃，法国 2 蒙彼利埃大学，34090 蒙彼利埃，法国 3 INSERM U1110 – 病毒和肝病研究所 (IVH) 4 斯特拉斯堡大学，67000 斯特拉斯堡，法国 5 斯特拉斯堡大学医院、大学医院研究所肝消化道中心，67000 斯特拉斯堡，法国
通过 CRISPR/Cas9 介导的同源重组将人类 gdnf 敲入牛 β-酪蛋白基因座*
帕金森病 (PD) 是一种常见且使人衰弱的神经退行性疾病，其源于多巴胺能神经元的损失，并伴有进行性运动功能障碍。神经胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF) 在治疗 PD 和其他神经病方面非常有前景。在本研究中，我们应用 CRISPR/Cas9 技术开发了一种基因靶向敲入系统，用于在牛 β-酪蛋白基因位点表达人类 gdnf 基因。构建了 CRISPR/Cas9 表达质粒和 pP40-GN 载体。使用组织外植体法培养和收集牛胎儿成纤维细胞。然后将 pP40-GN 和 CRISPR/Cas9 载体电转染到牛胎儿成纤维细胞中。使用 G418 筛选抗性克隆，同时通过 PCR 分析和 PCR 产物测序鉴定目标克隆。采用耳组织阻断法成功分离培养牛胎儿成纤维细胞，将pP40-GN靶载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418筛选，共获得12个健康、分离良好的细胞克隆，其中5个发生基因打靶事件。本研究为利用基因打靶牛乳腺生物反应器生产人GDNF蛋白奠定了基础，为PD的靶向治疗提供了新的策略。
利用 CRISPR-Cas9 和 Cre-Lox 系统在天然启动子的控制下生成条件突变敲入
通过产生突变来调节基因活性对理解蛋白质功能做出了重大贡献。然而，突变分析通常使用过表达研究，其中蛋白质脱离了其正常的环境和化学计量。在目前的研究中，我们试图开发一种方法，同时使用 CRISPR/Cas9 和 Cre-Lox 技术来修改内源性 SAT1 基因，以引入蛋白质的突变形式，同时仍受其天然基因启动子的控制。我们通过转录终止元件克隆了野生型 (WT) SAT1 的 C 末端部分，并在关键结合位点包含点突变的相同版本 SAT1 前面与 LoxP 位点相邻。在 CRISPR/Cas9 诱导的 DNA 双链断裂后，通过非同源末端连接 (NHEJ) 将构建体插入内源性 SAT1 基因座。在确认插入事件不会改变 SAT1 的正常功能后，我们便能够通过引入 Cre 重组酶来评估点突变的影响。因此，该系统能够生成内源性 WT SAT1 可以有条件地修改的细胞，并允许在正常启动子和染色质调节的背景下研究位点特异性突变的功能后果。
