摘要 测定Cas9对靶位点的切割效率对于基因组编辑非常重要。然而,这种测定只能通过体外方法进行,因为需要纯化Cas蛋白和合成gRNA。在这里,我们开发了一种体内方法,称为植物瞬时CRISPR/Cas编辑(TCEP)来测定Cas9的切割效率。按常规方法构建农杆菌介导的植物转化CRISPR/Cas载体。利用我们建立的瞬时转化方法,Cas9蛋白和gRNA瞬时表达并形成复合物以切割其靶位,从而导致动态DNA断裂。使用qPCR定量断裂的DNA以测量Cas9的切割效率。我们利用TCEP和体外方法研究了白桦和山杨×波利纳植物中Cas9对不同靶位点的切割效率。 TCEP法测定结果与体外法一致,说明TCEP法测定切割效率可靠。另外,利用TCEP法,我们发现热处理和超声处理均能显著提高CRISPR/Cas效率。因此,TCEP法具有广泛的应用价值,不仅可用于分析CRISPR/Cas效率,还可用于确定Cas9切割中涉及的因素。
参考:Becker La等。自然2017; 544:367–71。缩写:AAV9:腺相关病毒血清型9; ALS:肌萎缩性侧索硬化; atxn2:ataxin 2; AVB-205:AAV9-MIR-ATXN2; CB7:鸡β-肌动蛋白启动子;简历:变异系数; HKG:家政基因; HPRT1:低黄嘌呤 - 瓜氨酸磷酸贝糖基转移酶; ITR:反向终端重复; KD:敲除; mirna:microRNA; MOI:感染的多样性; mRNA:Messenger RNA; RNA:核糖核酸; RPP30:核糖核酸酶P蛋白亚基P30; RT-DDPCR:逆转录液滴数字聚合酶链反应; TDP-43:TAR DNA结合蛋白43; VG:病毒基因组。致谢和披露:这项研究由Aviadobio Ltd. RL,JK,LR,RJ,RJ,LL,IB,IB,JI,JI,AB,AM,AM,HC,HC,MM,PB是Aviadobio Ltd. RJ的雇员和/或股东,与VMIX™Platform and aviaDobio Ltd.RJ命名为AVIADOBIO LTD。根据国际医学杂志编辑委员会(ICMJE)的建议,作者符合作者身份标准。医学写作和社论支持由英国Costello Medical的Calum Suggett提供,并由Aviadobio Ltd.
青光眼是世界上视力丧失的主要原因之一,其特征是视网膜神经节细胞(RGC)的功能障碍。青光眼的早期病理机理是RGC的轴突的变性,发现可以预防轴突变性的新疗法引起了极大的关注。在许多神经退行性系统中,增加辅酶烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD)的浓度已被证明是轴突保护性。增加NAD可以通过增加参与神经元NAD,烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶2(NMNAT2)的末端酶的催化特性来实现。nmnat2是理想的治疗靶标。多酚A(PA),这是一种不会披露的多酚,已被证明是通过NMNAT2的正调制来提高NAD的。的目的是开发一种基于细胞的测定法,用于筛选PA和12个新型PA的类似物,以在从C57BL/6J小鼠中分离出脑皮质,视网膜和肝细胞中其NAD促进作用。进行了使用生物发光测定的方案,以优化变量,例如细胞浓度,底物(烟酰胺)浓度,PA浓度和孵育时间。该方法开发产生了一日测试PA及其在皮质细胞中类似物的方案。pa及其几个类似物表现出NAD促进效应。该方案以及筛选的结果可以进一步用于开发可预防青光眼以及其他轴突和神经退行性的新型药物。
1 年前ꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏ ꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏꞏ 1
现已明确,环氧合酶有两种不同的亚型。COX-1 在多种细胞类型中组成性表达,并参与正常细胞稳态。各种有丝分裂刺激物(如佛波醇酯、脂多糖和细胞因子)可诱导第二种 COX 亚型 COX-2 的表达。COX-2 负责急性炎症条件下前列腺素的生物合成。3 这种可诱导的 COX-2 被认为是非甾体抗炎药抗炎活性的靶酶。
摘要。开发了一种简单灵敏的分光光度法,用于测定空气中的二氧化氮和水、土壤、一些分析级化学品和牙膏中的亚硝酸盐。空气中的二氧化氮在碱性亚砷酸钠或三乙醇胺吸收剂溶液中以亚硝酸根离子的形式固定。该方法基于水介质中的亚硝酸盐与已知过量的中性红 (C.I.50040) 的反应,中性红是一种具有伯氨基的吖嗪染料,最大吸收波长为 530 nm。在酸性介质中,由于重氮化,颜色强度降低,随后脱氨。添加溴离子可提高重氮化速率,反应几乎立即完成。亚硝酸盐浓度为 0 – 20 µg 时,符合比尔定律,摩尔吸光度为 2.5 × 10 4 L mol –1 cm –1 。显色体系可稳定 2 天。染料可在碱性条件下用异戊醇提取,加入甲醇硫酸可恢复染料颜色。摩尔吸光度为 4.3 × 10 4 L mol –1 cm –1 。亚硝酸盐浓度为 0 – 1.6 µg 时,符合比尔定律,检测限为 0.15 µg。
根据国际和国家标准的要求,放入加热块中的样品必须在 10 分钟内加热到 148 ±3 °C 的消解温度,随后略微沸腾(不过度加热)并进一步消解。只有 behr 提供这种特殊的 COD 程序,可以根据需要向上或向下调节加热块温度。自动模式可补偿加热器和传感器之间的热损失,从而确保 COD 测定的消解符合标准。
摘要:在亚大气压条件下,对不同当量比的预混甲烷-空气火焰的层流火焰速度进行了实验测量,温度为 852 mbar 和 298 K。使用矩形端口燃烧器和水冷却系统获得火焰,水冷却系统是维持混合物温度恒定所必需的。使用 ICCD 相机捕获火焰中存在的 OH-CH 自由基发出的化学发光,从而定义火焰前沿。使用锥体方法计算层流火焰速度,并将实验结果与其他作者报告的结果以及使用软件 CHEMKIN 使用 GRIMECH 3.0 机制进行的数值模拟进行了比较。这项研究发现,将气压从 1013 mbar 降低到 852 mbar 可使层流火焰速度增加 7%。