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World File Search System电泳分离
电泳迁移率分析，以分离超螺旋，融合和打结的DNA分子
可以通过所谓的单分子方法（例如染色质纤维自显影术[1]，动态分子梳理[2]，透射电子显微镜[3-5]，原子力显微镜[6]和磁性Tweeezer [7,8]来分析具有不同拓扑的DNA分子的DNA分子。DNA特性很难通过计算机模拟[9-13]研究实验上的DNA特性。二维（2D）琼脂糖凝胶电泳是当前可用的最佳实验方法，可以同时鉴定具有不同拓扑的DNA分子[例如，超涂层（SC），catenated（catss），打结（cats）和打结（KN）分子（kN）分子]。该技术由在不同条件下进行的两个连续电泳分离组成，并在两个正交方向上运行（4-8）。在相对较低的电压（〜1 v/cm）下，在低度（〜0.4％）琼脂糖凝胶电泳中解析了第一维。第二维垂直于第一个维度，因此将整个凝胶的整个泳道用作凝胶井的替换，但在高度（〜1％）琼脂糖凝胶电泳（〜5–6.6 V/cm）处的高度（〜1％）琼脂糖凝胶电泳。2D凝胶最初是由Bell和Byers设计的，用于分离分支和线性分子[14]，并且早期注意到该方法也可以成功地应用于研究DNA拓扑。2D凝胶被调整以同时检查具有不同DNA拓扑的成千上万个分子，例如SC形式，KN形式，部分复制的形式（命名为前蛋白酶），有或没有反向的叉子，完全重复的Catenanes（Cats）（cats）和复制中间体（RIS），以及包含针（RIS）（RIS）（RIS）[4,6,6,6,6,6,6,6,6,6,6,6,6,6,58]。2D琼脂糖凝胶电泳已广泛用于研究拓扑异构酶体外和体内的活性[29,30]。另外，2D凝胶也可以用作富集特定DNA分子的样品的制备方法，以后可以通过不同的技术进行检查[4,6,18,19,31,32]。质粒是研究DNA拓扑模型的宝贵工具。质粒的优势包括它们的易于分离，以及在纯化的DNA样品中定量测量DNA超串联，打结和搭配的能力[33]。在这里，我们提出了一种协议，其中2D凝胶用于分析三个
补充材料
补充材料。材料与方法文库制备和 Miseq (Illumina®) 测序使用文库制备指南 (LPG) ( https://support.illumina.com/downloads/16s_metagenomic_sequencing_library_preparation.html ) 中报告的 Illumina 接头序列和引物悬垂部分（正向和反向）扩增 16S rRNA 基因的 460 bp V3-V4 高变区。使用以下 PCR 反应扩增每个 DNA 样本：2.5 µl 5 ng/ µl DNA、5 µl 引物正向悬垂部分、5 µl 引物反向悬垂部分、12.5 µl 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems)。使用 LPG 中报告的循环程序。 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶（GellyPhor LE，Euroclone SPA，意大利米兰）上电泳分离，并用 GelRed™ 核酸凝胶染料（Biotium，美国加利福尼亚州海沃德）染色。通过紫外光透射仪观察预期长度的 PCR 产物的存在。然后，用 NucleoMag 试剂盒纯化 DNA 扩增子以清理和选择 NGS 文库制备反应的大小（Macherey-Nagel），并按照制造商的说明使用 Illumina® DNA/RNA UD Indexes Tagmentation 试剂盒对每个样本进行索引。在验证和定量之前，对文库进行进一步纯化。在 Agilent 4150 TapeStation D1000 ScreenTape 检测仪（安捷伦科技公司）上对文库进行验证，以验证大小，而定量则使用 Qubit 4 荧光计（赛默飞世尔科技，美国）。根据 DNA 扩增子的大小，应用 Illumina LPG 中报告的公式，以 nM 为单位计算最终的 DNA 浓度。最后，将每个文库中的 5 µl 稀释 DNA 等分试样混合，以合并具有唯一索引的文库。在 Miseq 加载之前，根据 Illumina LPG 说明对合并的文库进行变性和稀释。使用 MiSeq Reagent Micro Kit v2（500 个循环）加载合并的文库，运行包括 20% PhiX 作为内部对照。生物信息学分析测序数据包含在包含带有原始读取的 FASTQ 文件的文件夹中（R1 文件包含每个样本的正向读取，R2 文件包含每个样本的反向读取），使用 FastQC（英国剑桥 Babraham Institute）进行质量检查。然后，使用 DADA2 R 包（Callahan 等人，2016 年）处理 R1 和 R2 文件以生成扩增子序列变体 (ASV)（图 1）。最终生成了 ASV 表，总结了每个样本的不同 ASV 的数量。