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World File Search System诱变
微生物多个染色体区域的定向诱变
定向进化可以有效地改造蛋白质、生物合成途径和细胞功能。传统的基于质粒的方法通常对一个或偶尔多个感兴趣的基因进行诱变，需要耗时的人工干预，并且进行诱变的基因在其原生基因组背景之外。其他方法不加选择地诱变整个基因组，这可能会扭曲结果。最近的重组工程和基于 CRISPR 的技术通过允许在其原生基因组背景下的多个预定位点上实现极高的突变率，从根本上改变了这一领域。在这篇综述中，我们重点介绍了最近的技术，这些技术可能允许在这些目标序列的原生基因组背景下在多个基因组位点上加速可调诱变。这些技术将通过四个主要标准进行比较，包括诱变规模、对多种微生物物种的可移植性、脱靶诱变和成本效益。最后，我们讨论这些技术进步如何为基础研究和生物技术开辟新的途径。
CRISPR/Cas9 介导的 SlATG5 诱变降低番茄果实对灰葡萄孢的抗性
摘要：番茄果实在贮藏期间极易受到主要病原菌灰葡萄孢（B. cinerea）的侵染。最近的研究表明，自噬在植物防御生物和非生物胁迫中至关重要。自噬相关基因5（ATG5）在自噬体的完成和成熟中起关键作用，并被灰葡萄孢菌快速诱导，但ATG5在番茄采后果实抗灰葡萄孢菌中的潜在机制尚不清楚。为了阐明SlATG5在番茄果实抗灰葡萄孢菌中的作用，本研究采用CRISPR/Cas9介导的SlATG5敲除技术。结果表明，slatg5突变体对灰葡萄孢菌的感染更加敏感，病害症状更加严重，抗病酶几丁质酶（CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（GLU）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）等活性降低。此外，研究还观察到接种灰葡萄孢菌后，slatg5突变体中水杨酸（SA）信号相关基因SlPR1、SlEDS1、SlPAD4、SlNPR1的相对表达量高于WT，而茉莉酸（JA）信号相关基因SlLoxD和SlMYC2的相对表达量低于WT。这些结果表明，SlATG5 通过抑制 SA 信号通路和激活 JA 信号通路正向调控番茄果实对灰霉病菌的抗性反应。
在哺乳动物细胞中细菌亮氨酸tRNA的定向进化，以增强非规范氨基酸诱变
图2。tRNA leu库设计和下一代测序选择数据。a）受体茎的序列对齐的WEBLOGO表示来自682个细菌trNA，表明每个位置在每个位置的每个残基相对丰度。编号方案相对于tRNA ecleu（面板b）。b）野生型大肠杆菌tRNA cuA leu的三叶草结构，通过随机使受体词干碱基对随机使图书馆生成方案。基础配对均通过根据框中显示的彩色方案在每个位置引入每个位置的成对替换来维护。随机化被限制以维持保守的序列元素（面板A）。c）在选择之后和之前，使用其在文库中的标准化丰度（以前/以前/丰度）在库中测量了库中每个突变体在库中的富集。进行了选择的两种生物学重复，并彼此绘制了这两种重复物中观察到的每个突变体的富集。d）显示了最高1％（最丰富）序列的共识序列。提供了WT-TRNA ecleu的序列作为参考。e）在存在或不存在1 mM帽的情况下，通过将每个tRNA ecleu突变体的活性与PLRS1和EGFP-39TAG一起转染中，与PLRS1和EGFP-39TAG进行了测试（另请参见图S5）。在无细胞提取物中测量了EGFP-39TAG的表达，
小麦白粉病的诱变揭示了一个控制NLR和串联激酶介导的免疫的基因
blumeria graminis f。 sp。tritici（BGT）是全球重要的真菌小麦病原体。某些小麦基因型包含抗霉菌抗性（PM）基因，这些基因编码了识别特定真菌分泌效应子蛋白的免疫受体，将其定义为活力（AVR）因子。识别AVR因子对于理解小麦抵抗的机制，功能和耐用性至关重要。在这里，我们提出了AVRXPOSE，这是一种通过在PM基因上产生抗病收益来鉴定BGT中AVR基因的方法。我们首先识别六个BGT突变体，并在PM3B和PM3C上获得毒力。他们都有响应AVRPM3 B2/C2基因或其启动子区域内的可转座元件的点突变，缺失或插入。我们进一步选择了PM3A上的六个突变体，旨在识别PM3A识别的尚未识别的AVRPM3 A3，此外还鉴定出预先描述的AVRPM3 A2/F2。令人惊讶的是，所获得的突变体中的PM3A毒力总是伴随着对无关的串联激酶抗性基因WTK4的额外毒力增益。未观察到对11个额外的R基因的毒力，表明PM3A和WTK4的毒力增加是特定的。几个独立获得的PM3A-WTK4突变体在BGT-646中具有突变，该基因编码了推定的，非分泌的Ankyrin重复蛋白。基因分析表明，BGT-646调节效应子的子集
开发诱变SOS反应的抑制剂，该反应抑制了奎诺酮抗生素抗性的演变
是开发抗生素佐剂的新兴靶标是细菌DNA修复和SOS反应途径，它控制了细菌胁迫期间的超突变，水平基因转移，持久细胞的形成和毒力的上调。8 - 13个细菌基因组中的DNA损伤可能是由中性粒细胞在感染过程中产生的氧化爆发或诱导DNA双链断裂（DSB）的抗生素治疗的氧化爆发。在细菌中，DSB的修复是由主要在革兰氏阳性细菌或RECBCD中发现的酶复合物ADDAB启动的，主要是在革兰氏负面的。9 ADDAB和RECBCD是ATP依赖性解旋酶 - 通过DNA加工的复杂生化机理起作用的核酸酶，14-16最终导致3 0单链DNA产生。15多重
所有植物育种技术都是相等的，但有些比其他植物技术更相等：GM和诱变的情况
对基因修饰（GM）食品的普遍反对是从对人类和环境健康构成风险的观念中发展的。其他用于植物遗传修饰的技术，例如性交叉和诱变育种，大多仍然没有受到挑战。这项研究旨在调查公众对植物育种技术的看法。特别是性交，诱变，转基因（GM）和基因编辑。可以预期，态度和意图将是最积极的，并且通过性十字架对植物遗传改良的风险最低。这些变量上的得分预计在诱变，GM和基因编辑之间相似。也可以预期，一旦参与者了解通过这些技术开发的食物，态度，意图和风险感知会改变（变得更加积极）。参与者报告了两个时间点的态度，意图和风险感知。在时间2时，向他们展示了通过性交，通用汽车和诱变开发的食物图片。结果表明，诱变是最负面的技术，而通过性十字的遗传发展通常被认为是阳性的。结果强调了消息传递的重要性，消费者态度的框架。
在人类原代 B 细胞中高效进行 CRISPR-Cas9 介导的诱变以识别浆细胞调节剂
人类 B 淋巴细胞是自身抗体介导疾病免疫疗法的有吸引力的靶点。基因编辑技术可以提供强大的工具来确定调节 B 细胞分化为浆细胞的基因调控网络，并确定预防和治疗自身免疫性疾病的新治疗靶点。在这里，我们描述了一种新方法，该方法使用 CRISPR-Cas9 技术在体外靶向人类原代 B 细胞中的基因以识别浆细胞调节剂。我们发现 sgRNA 和 Cas9 成分可以通过 RD114 假型逆转录病毒载体有效地递送到人类原代 B 细胞中。使用该系统，我们实现了大约 80% 的基因敲除效率。我们破坏了三种转录因子 IRF4、PRDM1 和 XBP1 的表达，并表明人类 B 细胞存活和浆细胞分化受到严重损害。具体而言，IRF4、PRDM1 和 XBP1 在浆细胞分化的不同阶段表达，IRF4、PRDM1 和 XBP1 靶向的 B 细胞分别无法进展到前浆母细胞、浆细胞状态和浆细胞存活。我们的方法为研究原代人类 B 细胞中的基因功能和确定用于治疗应用的新型浆细胞调节剂开辟了一条新途径。
经过精确编辑的克隆小牛基因组没有显示出脱靶事件或从头诱变增加的证据
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2021 年 1 月 29 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.01.28.428703 doi：bioRxiv 预印本
通过向玉米幼苗顶端分生组织注射寡核苷酸进行定向细胞诱变的植物体内测试系统
摘要 从寡核苷酸定向诱变 (ODM) 到 CRISPR 系统，基因组编辑工具都使用合成寡核苷酸进行核苷酸的靶向交换。目前，大多数基因组编辑方案依赖于具有体细胞克隆变异和植物再生限制的体外细胞或组织培养系统。因此，我们在此报告了一种用于优化 ODM 的替代植物细胞测试系统，该系统基于将寡核苷酸溶液注射到单倍体玉米幼苗的顶端分生组织区域。使用 5′-荧光素标记的寡核苷酸，我们检测到合成 DNA 分子在茎尖分生组织细胞和叶原基维管束中的积累。为了沉默或敲低体细胞中的八氢番茄红素去饱和酶基因，将带有 TAG 终止密码子的 41 碱基长的单链寡核苷酸注射到玉米幼苗中。我们检测到长出的 M1 幼苗长出了带有白色条纹或浅绿色的叶子。白色条纹的共聚焦显微镜显示，除了叶绿素荧光缺乏的组织区域外，白色条纹中还存在含叶绿素的细胞。对白色条纹的 DNA 样本进行 Ion Torrent 测序表明，八氢番茄红素去饱和酶基因中的 TAG 终止密码子的读取频率为 0.13–1.50%。在将寡核苷酸分子注射到玉米幼苗的茎尖分生组织区域后，出现褪绿异常支持了寡核苷酸分子的诱变性质。所述方案为在幼苗早期阶段表征具有不同化学性质的诱变寡核苷酸的功能以及在植物水平上测试各种处理组合的效率提供了基础。
新型植物育种技术 - 欧洲议会
2018 年 7 月 25 日，应法国国务委员会 (Conseil d'État) 的要求，欧盟法院作出判决 (Case C-528/16)，裁定通过新诱变技术获得的生物体属于转基因生物，属于欧盟转基因生物立法的范围 (关于故意向环境中释放转基因生物的 2001/18/EC 指令)。根据该裁决，通过诱变技术获得的生物体属于转基因生物，诱变技术是一套无需插入外来 DNA 即可改变生物物种基因组的技术，原则上受欧盟范围内相关授权、可追溯性和标签规则规定的义务约束。法院认为，通过诱变技术获得的生物体属于转基因生物，因为这些技术和方法“以非自然发生的方式”改变了遗传物质。然而，通过诱变技术获得的生物体，这些生物体传统上已在许多应用中使用，并且具有长期的安全记录，因此仍不受这些义务的约束。监管新技术的背景