方法 • 开发了生物信息学流程来识别和确定全基因组基因间整合位点的优先顺序,并筛选了引导 RNA(gRNA)切割效率、基因盒整合效率、由此产生的细胞适应性和 GFP 表达水平的位点,• 构建了着陆垫系统以实现在一轮转化中多个基因或基因的多拷贝的整合,• 通过整合多个拷贝的 5-氨基乙酰丙酸合酶来产生 5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)和使用单个 gRNA 产生琥珀酸的生物合成途径,在 I. orientalis 中展示了该系统。
非传统酵母东方伊萨酵母 (Issatchenkia orientalis) 的强健特性使其能够在高酸性条件下生长,因此,人们对使用多种碳源生产有机酸的兴趣日益浓厚。最近,东方伊萨酵母的遗传工具箱的开发,包括附加型质粒、多个启动子和终止子的特征以及 CRISPR-Cas9 工具,简化了东方伊萨酵母的代谢工程工作。然而,由于缺乏有效的多拷贝整合工具,多重工程仍然受到阻碍。为了促进通过多重 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑构建大型复杂代谢途径,我们开发了一条生物信息学流程来识别和确定全基因组基因间位点的优先级,并表征了位于 21 个基因间区域的 47 个 gRNA。对这些位点进行了向导 RNA 切割效率、基因盒的整合效率、由此产生的细胞适应度和 GFP 表达水平的筛选。我们进一步利用来自这些已充分表征的基因座的组件开发了一种着陆垫系统,该系统可帮助利用单个引导 RNA 和用户选择的多个修复模板整合多个基因。我们已经证明了利用着陆垫同时将 2、3、4 或 5 个基因整合到目标基因座中,效率超过 80%。作为概念验证,我们展示了如何通过一步整合多个位点的五个基因拷贝来提高 5-氨基乙酰丙酸的产量。我们进一步证明了该工具的效率,即利用单个引导 RNA 和五个不同的修复模板整合五个基因表达盒,构建了琥珀酸生产代谢途径,从而在批量发酵中生产出 9 g/L 的琥珀酸。这项研究证明了单个 gRNA 介导的 CRISPR 平台在非传统酵母中构建复杂代谢途径的有效性。该着陆垫系统将成为 I. orientalis 代谢工程的宝贵工具。
Rebecca (Becky) K. Lutte 博士 Rebecca (Becky) Lutte 博士是内布拉斯加大学奥马哈航空学院的副教授。其学位包括安柏瑞德航空大学专业航空学学士学位;内布拉斯加大学奥马哈分校公共管理硕士 (MPA) 和哲学博士学位。Lutte 博士现任商用飞行员、CFII、MEI、实验飞机拥有者,并活跃于通用航空界。她被交通部部长任命为美国联邦航空局航空女性咨询委员会成员,并担任“了解问题和行业趋势”小组委员会主席。她还担任大学航空协会董事会成员。Lutte 博士开展各种主题的研究,主要关注航空劳动力发展以及航空女性的推广、招聘和留任。她在各种学术期刊、杂志和书籍上发表了 25 多篇文章。 2019 年,她发表了《航空业女性劳动力报告》,以解决缺乏有关从事航空职业的女性人数数据的问题。Lutte 博士曾多次发表演讲和接受采访,被《福布斯》、《CNN》、《美国国家公共电台》、《航空周刊与空间技术》、《通用航空新闻》和《女性航空杂志》引用。Lutte 博士曾获得多项奖项,包括大学航空协会 (UAA) 索伦森航空研究和学术杰出成就奖和 99 年代航空贡献成就奖。
2020年12月28日回复,请参阅:ISO New England Inc. Braintree Electric Light部门; NSTAR Electric Company; Chicopee电灯部;缅因州中部电力公司;缅因州电力公司(MEPCO);康涅狄格州市政电力合作社和康涅狄格州传输市政电力合作社;霍利奥克天然气和电力部;新罕布什尔州传输有限责任公司;绿山电力公司;马萨诸塞州市政电力公司;新英格兰电力公司;新罕布什尔州电气合作公司;康涅狄格州电力公司,马萨诸塞州西部电力公司和新罕布什尔州的公共服务公司;哈德逊镇灯和电力部;米德尔伯勒镇天然气电气部;诺伍德市政灯镇;读镇市政灯部;沃灵福德镇(CT)电力部;汤顿市照明厂;联合照明公司; Unitil Energy Systems,Inc。和Fitchburg Gas and Electric Light Company;佛蒙特州电气合作公司;佛蒙特州电力公司,Inc。和Vermont Transco,LLC; Versant Power F/A/A Emera缅因州;佛蒙特州公共电力供应机构;什鲁斯伯里电气和电缆操作案号ER20-2054-000
