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利用链球菌进行体内多重基因靶向...
胰腺导管腺癌是一种致命的癌症类型，与体细胞中的多种基因突变有关。基因工程小鼠几乎不适用于开发胰腺癌模型，异种移植模型在反映早期胰腺癌方面存在局限性。因此，使用成簇的规律间隔的短回文重复序列进行体内体细胞基因工程用于生成胰腺癌动物模型越来越受到关注。在本研究中，我们选择了 Kras、Trp53、Ink4a、Smad4 和 Brca2 作为靶基因，并应用空肠弯曲菌 Cas9 (CjCas9) 和化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 通过腺相关病毒 (AAV) 转导来开发胰腺癌。在确认 AAV2 的多灶性和弥漫性转导后，我们生成了 SpCas9 过表达小鼠，该小鼠在两次 AAV 转导后表现出靶基因中高双链 DNA 断裂 (DSB) 和胰腺上皮内瘤变 (PanIN) 病变；然而，三次 AAV 转导的野生型 (WT) 小鼠没有出现 PanIN。此外，将小型 Cjcas9 应用于具有两个 AAV 系统的 WT 小鼠，该小鼠还出现了高广泛性 DSB 和 PanIN 病变。观察到了导管和胰岛细胞中的组织学变化和癌症标志物（如 Ki67、细胞角蛋白、Mucin5a、α 平滑肌肌动蛋白）的表达。此外，研究还揭示了几个发现，例如 1) AAV-CjCas9 的多重 DSB 潜力、2) 导管周围淋巴细胞浸润、3) 多灶性癌症标志物表达，以及 4) 在 AAV 介导的靶向中启动 PanIN 需要 12 个月以上。在这项研究中，我们提出了一种用于体内癌症建模的有用工具，该工具也适用于其他疾病模型。
通过单次静脉注射载体进行体内碱基编辑以治疗血红蛋白病
简介 自体造血干细胞 (HSC) 基因疗法治疗血红蛋白病已显示出良好的临床疗效 (1–4)。然而，目前的方案包括分离患者 HSC、使用整合载体进行体外基因改造以及在骨髓毒性 BM 调理后重新输注改造后的 HSC，这些方案在技术上很复杂且成本高昂。我们正试图开发一种体内 HSC 基因治疗方法，这种方法不需要骨髓消融和整合载体，而且在技术上更容易。在这种方法中，我们使用衣壳修饰的辅助依赖性 HDAd5/35++ 载体 (1, 2)。这些载体靶向 CD46，这是一种在原始 HSC 上表达的受体 (2, 3)。在通过常规用于 HSC 动员/收获的药剂将 HSC 从 BM 动员后，将 HDAd5/35++ 载体静脉注射。动员的 HSC 在周围时被转导。大部分 HSC 返回 BM。动员造血干细胞对于体内转导至关重要，因为在骨髓中，造血干细胞被细胞外基质蛋白包围（4），基因转移载体无法接触（2）。为了扩增体内转导的造血干细胞，我们目前使用一种基于突变 O 6 -甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（mgmt P140K）基因的体内选择机制，该基因可产生对 O 6 -BG/BCNU 的抗性
NEP_SYLLABUS_MICROBIOLOGY_4TH SEM.docx
遗传交换机制 DNA 作为遗传物质：格里菲斯转化实验、艾弗里、麦克劳德和麦卡锡实验、赫尔希和蔡斯实验证明 DNA 携带遗传信息。弗兰克尔-康拉特实验证明 RNA 是遗传物质。原核生物染色体的结构和组织。质粒类型、原核生物中的转座子。细菌转化：原核生物中发现的转化机制的原理和类型。细菌结合：U 型管实验、F 质粒的特性、F + x F - 结合、Fʹ x F - 结合、Hfr x F - 结合、转导：广义和专门的转导
构建病毒载体用于声学靶向基因传递
设计病毒载体进行声学靶向基因传递 Hongyi Li 1、John E. Heath 1、James S. Trippett 3、Mikhail G. Shapiro 2,*、Jerzy O. Szablowski 2,3,4 * 1 美国加利福尼亚州帕萨迪纳市加州理工学院生物与生物工程部 2 美国加利福尼亚州帕萨迪纳市加州理工学院化学与化学工程部 3 美国德克萨斯州休斯顿市莱斯大学生物工程系 4 美国德克萨斯州休斯顿市莱斯大学莱斯神经工程计划 * 通信地址为 MGS (mikhail@caltech.edu) 和 JOS (jszab@rice.edu) 摘要 靶向基因传递到大脑是神经科学研究的重要工具，并且具有治疗人类疾病的巨大潜力。然而，腺相关病毒 (AAV) 等常见基因载体的位点特异性递送通常通过侵入性注射进行，这限制了它们的研究和临床应用范围。或者，非侵入性地进行的聚焦超声血脑屏障开放 (FUS-BBBO) 使 AAV 能够从体循环进入大脑的位点特异性。然而，当与天然 AAV 血清型结合使用时，这种方法的转导效率有限，需要接近组织损伤极限的超声参数，并导致不良的外周器官转导。在这里，我们使用高通量体内选择来设计专门设计用于 FUS-BBBO 部位局部神经元转导的新型 AAV 载体。所得载体显著增强了超声靶向基因递送和神经元向性，同时减少了外周转导，使靶向特异性提高了十倍以上。除了增强唯一已知的非侵入性靶向基因递送到特定大脑区域的方法外，这些结果还确立了 AAV 载体进化为特定物理递送机制的能力。
个性化新抗原反应性TCR的收养转移...
使用新抗原反应性T淋巴细胞的收养细胞转移（ACT）可以介导癌症的回归。在这里，我们从转移性胃肠道癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞中分离出独特的，个性化的，新抗原的T细胞受体（TCR），并将TCRα和β链掺入Gamma逆转录病毒中。我们转导自体外周血淋巴细胞，并在淋巴结化的化学疗法后采用这些细胞将这些细胞转移到患者中。在第二阶段的单臂研究中，我们治疗了7例转移性，不匹配修复功能不匹配的结直肠癌的患者，这些癌症患有多种先前疗法后患有进行性疾病。研究的主要终点是使用recist 1.1测量的客观响应率，次要终点是安全性和耐受性。本研究中没有定义的预先指定的临时分析。三名患者通过恢复标准具有客观的临床反应，包括持续4至7个月的肝脏，肺部和淋巴结的转移回归。所有患者接受了含有≥50％TCR转导细胞的T细胞群体，并且所有T细胞群体都是多功能的，因为他们分泌IFNγ，GM-CSF，IL-2和GRANZYME B，其与野生型对抗相比，是针对突变肽的响应。TCR转导的细胞，包括三个反应者，在ACT后1个月，CD3 +细胞的水平≥10％。在一名对治疗反应的患者中，约有20％的CD3 +外周血淋巴细胞表达了2年后的TCR转导TCR。临床。GOV注册：NCT03412877。这项研究提供了早期的结果，表明对T细胞进行遗传修饰以表达个性化的新抗原反应性TCR，可以耐受性耐受性，并且可以介导转移性结直肠癌患者的肿瘤消退。
最大化吞吐量的定量西方结果
（a）上面显示的是来自单个LEO运行的数据。使用重组GFP蛋白的8点标准曲线在弹药筒上三次。墨盒2、3和4用于定量来自2种不同批次和各种剂量的转导细胞裂解物中的GFP表达。重组蛋白以2.5 ng/ml的速度作为校准器在所有墨盒上作为用于墨盒校正的校准器。（b）上面显示的是来自单个JES运行的数据。使用重组GFP蛋白的8点标准曲线运行，并用于定量来自2个不同批次转导的细胞裂解物中的GFP表达。总体而言，每杰西斯运行的毛细血管数量有限，只能容纳标准曲线的一个复制和有限数量的样品。在杰西系统上处理96个样本至少需要4次运行和12小时。
直接注射的慢病毒载体 T 细胞疫苗可保护小鼠免受急性和慢性病毒感染
基于慢病毒载体的树突状细胞疫苗在动物模型中诱导保护性 T 细胞反应，以抵抗病毒感染和癌症。在本研究中，我们测试了是否可以通过直接注射表达抗原的慢病毒载体来实现预防性和治疗性疫苗接种，从而避免体外转导树突状细胞。注射的慢病毒载体优先转导脾脏树突状细胞并导致长期表达。注射编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 的 MHC I 类限制性 T 细胞表位和 CD40 配体的慢病毒载体可诱导抗原特异性细胞溶解性 CD8 + T 淋巴细胞反应，从而保护小鼠免受感染。向慢性感染小鼠注射编码 LCMV MHC I 类和 II 类 T 细胞表位和可溶性程序性细胞死亡 1 微体的慢病毒载体可迅速清除病毒。通过直接注射慢病毒载体进行疫苗接种对无菌 α 基序和含有 HD 结构域的蛋白 1 敲除 (SAMHD1 敲除) 小鼠更有效，这表明含有 Vpx（一种通过诱导 SAMHD1 降解来提高树突状细胞转导效率的慢病毒蛋白）的慢病毒载体将成为治疗人类慢性疾病的有效策略。
直接注射的慢病毒载体 T 细胞疫苗可保护小鼠免受急性和慢性病毒感染
基于慢病毒载体的树突状细胞疫苗在动物模型中诱导保护性 T 细胞反应，以抵抗病毒感染和癌症。在本研究中，我们测试了是否可以通过直接注射表达抗原的慢病毒载体来实现预防性和治疗性疫苗接种，从而避免体外转导树突状细胞。注射的慢病毒载体优先转导脾脏树突状细胞并导致长期表达。注射编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 的 MHC I 类限制性 T 细胞表位和 CD40 配体的慢病毒载体可诱导抗原特异性细胞溶解性 CD8 + T 淋巴细胞反应，从而保护小鼠免受感染。向慢性感染小鼠注射编码 LCMV MHC I 类和 II 类 T 细胞表位和可溶性程序性细胞死亡 1 微体的慢病毒载体可迅速清除病毒。通过直接注射慢病毒载体进行疫苗接种对无菌 α 基序和含有 HD 结构域的蛋白 1 敲除 (SAMHD1 敲除) 小鼠更有效，这表明含有 Vpx（一种通过诱导 SAMHD1 降解来提高树突状细胞转导效率的慢病毒蛋白）的慢病毒载体将成为治疗人类慢性疾病的有效策略。
系统性多性状 AAV 衣壳工程实现高效基因传递
扩大基因治疗应用需要可制造的载体，这些载体可以有效地传导人类和临床前模型中的靶细胞。传统的腺相关病毒 (AAV) 衣壳文库选择方法无法在广阔的序列空间中搜索一小部分具有临床转化所必需的多种性状的载体。在这里，我们介绍了 Fit4-Function，这是一种可通用的机器学习 (ML) 方法，用于系统地设计多性状 AAV 衣壳。通过利用均匀采样可制造序列空间的衣壳文库，可以生成可重复的筛选数据来训练准确的序列到功能模型。结合六种模型，我们设计了一个多性状（肝脏靶向、可制造）衣壳文库，并根据所有六个预定标准验证了 88% 的文库变体。此外，仅使用小鼠体内和人类体外 Fit4Function 数据进行训练的模型准确预测了 AAV 衣壳变体在恒河猴中的生物分布。顶级候选物表现出与 AAV9 相当的生产产量、高效的小鼠肝脏转导、高达 1000 倍的人类肝细胞转导以及在恒河猴肝脏转导筛选中相对于 AAV9 的富集度增加。Fit4Function 策略最终使得预测肽修饰 AAV 衣壳的跨物种性状成为可能，并且是组装预测 AAV 衣壳在数十种性状中表现的 ML 图谱的关键一步。
MicrofluidX 和 CCRM 合作开展端到端...
MicrofluidX 和 CCRM 合作实现 CAR-T 细胞疗法的端到端生物处理 英国斯蒂夫尼奇和加拿大多伦多，2023 年 1 月 11 日 — MicrofluidX (MFX) 是一家总部位于英国的下一代细胞研究和制造生物反应器供应商，今天宣布与 CCRM 合作，后者是基于再生医学的技术以及细胞和基因疗法的开发和商业化的领导者，通过其下一代平台 Cyto Engine™ 推进慢病毒 (LV) CAR-T 细胞的生产。该项目将满足对更高转导效率、更高转导细胞群体均质性、更短生物处理时间和封闭系统自动化的迫切需求。早期试验（数据可在此处获得）表明，与传统方法相比，MFX 生物反应器中的原代 T 细胞转导效率可提高 5 倍（或病毒消耗量降低 10 倍），均质性提高 2 倍。 “工程慢病毒仍然是 CAR-T 基因编辑最受欢迎的载体，但目前的方法会消耗大量病毒，而细胞产生的载体拷贝数范围很广。这导致人们使用非病毒方法，而这本身也带来了挑战。我们对这次合作感到非常兴奋，因为我们将能够证明事情不必如此。我们平台中的病毒编辑细胞具有高度活力、高度转导和高度同质性，而病毒量仅为以前使用的一小部分，”MicrofluidX 首席执行官 Antoine Espinet 表示。“CCRM 熟练的工艺开发团队一直致力于解决细胞和病毒载体制造中的挑战，包括关闭和自动化流程，我们经常与全球尖端技术提供商合作，”CCRM 总裁兼首席执行官 Michael May 解释道。“与 MicrofluidX 合作的这个项目是一个开发更高效、更低成本的工艺的机会，可以帮助治疗开发人员。当行业能够降低制造成本时，患者将受益。”目前，病毒被设计成载体，将遗传物质带入 T 细胞，增强细胞的特定治疗特性，例如肿瘤检测。然而，这些病毒的生产过程很复杂，因此几微升病毒的成本可能高达数千美元。此外，传统的生物反应器无法精细控制病毒颗粒与细胞的相互作用，导致一部分细胞未受感染，而一部分细胞被多次感染。由于只有受感染的细胞才具有治疗用途，因此需要较长的扩增阶段才能获得可剂量的细胞数量。此外，对重复感染的细胞百分比（载体拷贝数）有严格的放行标准，导致最终产品的产量较低。因此，细胞和基因治疗行业对受控转导平台的需求尚未得到满足，这种平台可以降低病毒消耗，使每个细胞感染率接近一次。此外，对封闭式自动化平台的需求也更为广泛，这种平台可以通过细胞选择、激活、转导、扩增、浓缩和配制，端到端地处理 CAR-T 细胞。MicrofluidX 相信 Cyto Engine™ 平台将满足这些需求，降低细胞治疗制造的成本和时间，并缩短向患者提供救命治疗的时间。通过这个项目，MFX 和 CCRM 将评估 MFX 平台与 CCRM 的流程、员工和设施的能力。反馈将用于进一步改进平台，CCRM 将能够根据其需求设计实验。