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综述：利用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑工具对免疫系统细胞进行重编程的创新策略：癌症管理的新时代
摘要：成簇的规律间隔短回文重复序列/相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 系统研究的最新进展彻底改变了基因组编辑技术及其在细胞分化和免疫反应行为中的应用。该技术进一步帮助人们了解癌症进展的奥秘，并可能设计出新的抗肿瘤免疫疗法。基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑现在通常用于设计配备重组 T 细胞受体 (TCR) 或嵌合抗原受体 (CAR) 的通用 T 细胞。此外，该技术还用于细胞因子刺激、抗体设计、自然杀伤 (NK) 细胞转移以及克服免疫检查点。CRISPR/Cas9 在制备过继细胞转移 (ACT) 免疫疗法构建块方面的创新潜力为抗肿瘤免疫疗法打开了一扇新的窗口，其中一些已经获得了 FDA 批准。免疫遗传调节剂的操纵为免疫肿瘤学中基于 CRISPR/Cas9 的筛选的设计、实施和解释开辟了新的界面。淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌和肝癌等多种癌症都已采用这种策略治疗，而这种策略曾被认为是不可能的。在免疫细胞内安全有效地传递 CRISPR/Cas9 系统以实现基因组编辑策略是一项具有挑战性的任务，需要对其进行分类才能实现有效的免疫治疗。已经使用了多种靶向方法，例如病毒介导、电穿孔、微注射和基于纳米制剂的方法，但每种方法都有一些局限性。在这里，我们详细介绍了通过免疫疗法与 CRISPR/Cas9 技术合作进行癌症管理的最新进展。此外，我们还阐述了一些创新方法，这些方法将这种基因组编辑系统靶向免疫系统细胞内以对其进行重新编程，作为一种新的抗癌免疫治疗策略。此外，还讨论了未来的前景和临床试验。关键词：CRISPR/Cas9、肿瘤微环境、免疫反应、分子靶向治疗、癌症免疫治疗、纳米技术、临床研究
增强自然杀伤细胞以克服癌症对 NK 细胞疗法的耐药性并增强抗体免疫疗法
自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫系统的细胞成分，可以识别和抑制癌细胞的增殖。NK 细胞可以通过直接裂解、分泌穿孔素和颗粒酶或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 来消除癌细胞。ADCC 涉及 NK 细胞上的 Fc 伽马受体 IIIa (CD16) 与已经与癌细胞结合的抗体的恒定区结合。癌细胞使用多种机制来逃避 NK 细胞的抗肿瘤活性，包括抑制性细胞因子的积累、免疫抑制细胞（如髓源性抑制细胞 (MDSC) 和调节性 T 细胞 (Treg)）的募集和扩增、NK 细胞受体的配体的调节。已经开发了几种策略来增强 NK 细胞的抗肿瘤活性，目的是克服癌细胞对 NK 细胞的抵抗力。改造和增强 NK 细胞毒性的三种主要策略包括使用调节性细胞因子增强 NK 细胞、过继性 NK 细胞疗法以及使用改造的 NK 细胞来增强基于抗体的免疫疗法。尽管前两种策略提高了基于 NK 细胞的疗法的疗效，但仍存在一些局限性，包括免疫相关不良事件、诱导免疫抑制细胞以及进一步产生对 NK 细胞杀伤的癌症抵抗力。克服这些问题的一种策略是结合介导 ADCC 的单克隆抗体 (mAb) 和具有增强抗癌活性的改造 NK 细胞。使用具有 ADCC 活性的 mAb 的优势在于它们可以激活 NK 细胞，但也有利于免疫效应细胞在肿瘤微环境 (TME) 中的积累。多项临床试验报告称，与单独使用 mAb 相比，将改造的 NK 细胞与具有 ADCC 活性的 mAb 相结合可以产生更好的临床反应。下一代临床试验采用工程化 NK 细胞和对 NK 细胞上表达的 CD16 具有更高亲和力的 mAb，将为癌症患者提供更有效、更高质量的治疗。
基于细胞的抗慢病毒转导人工 APC，可从各种细胞来源有效生成 CAR-T 细胞
摘要 背景 嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T) 的过继细胞疗法已经成为某些侵袭性 B 细胞恶性肿瘤患者的标准治疗方法，并有望在未来改善许多其他癌症患者的护理。然而，CAR-T 细胞疗法的高制造成本对其更广泛的临床应用构成了重大障碍。CAR-T 生产的主要成本驱动因素包括用于 T 细胞活化的一次性试剂和临床级病毒载体。起始材料中存在不同数量的污染单核细胞对 CAR-T 制造构成了额外的挑战，因为它们会阻碍 T 细胞刺激和转导，导致制造失败。方法我们创建了基于 K562 的人工抗原呈递细胞 (aAPC)，具有基因编码的 T 细胞刺激和共刺激，这是 T 细胞活化的取之不尽的来源。我们还使用 CRISPR-Cas9 基因编辑核酸酶破坏了这些 aAPC（aAPC- Δ LDLR）上低密度脂蛋白受体 (LDLR) 的内源性表达，以防止意外慢病毒转导并避免转导过程中对病毒载体的吸收效应。使用各种 T 细胞来源，我们通过基于 aAPC- Δ LDLR 的激活产生了 CD19 导向的 CAR-T 细胞，并在体外和体内测试了它们对 B 细胞恶性肿瘤的抗肿瘤效力。结果我们发现 aAPC- Δ LDLR 上缺乏 LDLR 表达会导致 CAR-T 生产过程中对慢病毒转导产生抗性。使用 aAPC- Δ LDLR，我们甚至可以从未纯化的起始材料（如外周血单核细胞或未经处理的白细胞分离术产品，其中含有大量单核细胞）中实现 CAR-T 细胞的有效扩增。我们通过基于 aAPC- Δ LDLR 的扩增产生的 CD19 定向 CAR-T 细胞在急性淋巴细胞白血病和 B 细胞淋巴瘤的临床前模型中表现出强大的抗肿瘤反应。结论我们的 aAPC- Δ LDLR 代表了一种用于制造慢病毒转导 T 细胞的有吸引力的方法
CRISPR 介导的 TGFBR2 敲除使人类卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞对 TGF-β 信号产生抗性
摘要 背景 卵巢癌 (OvCa) 患者 T 细胞浸润升高与生存率提高之间的相关性表明内源性肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 具有一定程度的抗肿瘤活性，可用于 OvCa 免疫治疗。我们之前优化了一种体外 OvCa TIL 扩增用于过继细胞疗法的方案，该方案目前正在我们机构的临床试验中进行测试 (NCT03610490)。在此成功的基础上，我们开始对 OvCa TIL 进行基因改造，以克服肿瘤微环境中存在的关键免疫抑制因素。在这里，我们介绍了在患者来源的 OvCa TIL 中 CRISPR/Cas9 介导的 TGF-β 受体 2 (TGFBR2) 敲除的临床前优化。方法 从四名患者手术切除的肿瘤样本中生成 OvCa TIL，并进行 CRISPR/Cas9 介导的 TGFBR2 敲除，然后进行快速扩增方案。全面评估了 TGFBR2 定向 gRNA 的 TGFBR2 敲除效率和脱靶活性。此外，还测定了 TGFBR2 敲除对 TIL 扩增、功能和下游信号传导的影响。结果在四个独立的 OvCa TIL 样本中测试的 5 个 gRNA 实现了从 59±6% 到 100%±0% 的 TGFBR2 敲除效率。TGFBR2 敲除的 TIL 对免疫抑制 TGF-β 信号传导具有抗性，表现为缺乏 SMAD 磷酸化、缺乏对 TGF-β 刺激的整体转录变化、在有和没有 TGF-β 的情况下促炎细胞因子的分泌同样强烈、并且在存在 TGF-β 的情况下细胞毒性增强。CRISPR 修饰本身不会改变 OvCa TIL 的体外扩增效率、免疫表型或 TCR 克隆多样性。对于临床转化而言，重要的是，对 CRISPR 脱靶效应的全面分析表明，我们前两个靶向 TGFBR2 的 gRNA 没有脱靶活性的证据。结论 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除在患者来源的 OvCa TIL 中是可行且有效的，可使用临床可扩展的方法。我们实现了高效且特异性的 TGFBR2 敲除，产生了一种扩增的 OvCa TIL 产品，该产品对免疫抑制剂具有抗性
Tazzari Marcella CV English_29.08.2022 网站
个人信息 地址 电话 电子邮件 marcella.tazzari@irst.emr.it 出生日期和地点 工作经历 2020 年 7 月 1 日 - 至今 IRCCS Istituto Romagnolo per lo Studio dei Tumori (IRST) "Dino Amadori" Srl 博士后研究员，免疫疗法部门 - 细胞疗法和生物库。免疫微环境、过继和疫苗方法计划协调员。 2017 年 6 月 19 日 - 2020 年 7 月 1 日 IRCCS Istituto Romagnolo per lo Studio dei Tumori (IRST) "Dino Amadori" Srl 博士后研究员，免疫疗法部门 - 细胞疗法和生物库，协调员 Massimo Guidoboni。 2016 年 6 月 1 日 - 2017 年 12 月 31 日 在肿瘤免疫学实验室担任博士后研究员，该实验室由 Carl Figdor 教授领导，肿瘤免疫学系，拉德堡德分子生命科学研究所（RIMLS，拉德堡德姆，奈梅亨，荷兰）。2014 年 6 月 25 日 - 2016 年 5 月 15 日 在意大利米兰国家肿瘤研究所 Fondazione IRCCS 担任博士后研究员，人类肿瘤免疫治疗部门（Licia Rivoltini 实验室），实验肿瘤学和分子医学系。 2011 年 1 月 1 日 - 2014 年 6 月 24 日 意大利米兰国立肿瘤研究所基金会博士生，人体肿瘤免疫治疗中心 (Licia Rivoltini 实验室)，实验肿瘤学和分子医学系。 2009 年 11 月 1 日 - 2010 年 12 月 31 日 意大利米兰国立肿瘤研究所基金会研究生，人体肿瘤免疫治疗中心 (Licia Rivoltini 实验室)，实验肿瘤学和分子医学系。 2008 年 5 月 15 日 - 2009 年 2 月 15 日 瑞典卡罗琳斯卡医院卡罗琳斯卡癌症中心肿瘤病理学系 Rolf Kiessling 教授实验室硕士论文学生。教育与培训 2011 年 1 月 1 日 - 2014 年 6 月 24 日 与米兰大学合作建立生物与分子科学博士学院。
免疫治疗后影像学检查评估肿瘤反应
近年来，已开发出各种系统性免疫疗法用于癌症治疗，例如针对免疫检查点的单克隆抗体 (mAB)（免疫检查点抑制剂，ICI）、溶瘤病毒、细胞因子、癌症疫苗和过继细胞转移。尽管估计有 38.5% 的转移性实体瘤或血液肿瘤患者可以使用 ICI，但 ICI 尤其能在许多肿瘤疾病（例如黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌）中表现出持久的疾病控制效果，并且具有总体生存优势。由于免疫疗法基于 T 细胞活化的独特作用机制，其反应具有不同的模式，例如治疗反应之前的进展（假进展）、过度进展和治疗后的分离反应。由于这些特征在肿瘤学疗效评估标准《实体肿瘤疗效评价标准》1.1版（RECIST 1.1）中没有出现，因此为免疫疗法制定了新的标准。这些新的形态学标准中最重要的变化是，首先，在出现进展的情况下需要进行确认性影像学检查，其次，出现新病变不一定被视为进展性疾病。到目前为止，已经开发了五种形态学标准（免疫相关疗效标准（irRC）、免疫相关 RECIST（irRECIST）、免疫 RECIST（iRECIST）、免疫修改 RECIST（imRECIST）和肿瘤内 RECIST（itRECIST））标准，以准确评估靶病变大小的变化，同时考虑到免疫治疗后的具体反应模式。除了形态学反应标准外，2-脱氧-2-[ 18 F] 氟-D-葡萄糖正电子发射断层扫描/计算机断层扫描 ( 18 F-FDG-PET/CT) 也是评估代谢反应的一个有前途的选择，并且使用了四个代谢标准（免疫检查点抑制剂治疗反应的早期预测 PET/CT 标准 (PECRIT)、免疫治疗的 PET 反应评估标准 (PERCIMT)、实体肿瘤的免疫治疗修改的 PET 反应标准 (imPERCIST5) 和免疫 PERCIST (iPERCIST))。此外，有证据表明，18 F-FDG-PET/CT 上的参数，例如标准化摄取值 (SUV)max 和几种放射性示踪剂（例如针对 PD-L1 的放射性示踪剂），可能是反应的潜在成像生物标志物。此外，人类肿瘤内免疫治疗（HIT-IT）的出现，其特点是将免疫刺激剂直接注射到肿瘤病变中，这赋予了
唑来膦酸扩增的自体 Vγ9Vδ2 T 细胞在治疗难治性非小细胞肺癌患者中的过继转移：一项多中心、开放标签、单组、 2 期研究
摘要 背景 并非所有非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者都具有药物可靶向的驱动突变，并且对免疫检查点阻断疗法的反应率也仍然不令人满意。 因此，仍然需要更有效的治疗方法。 在这里，我们报告了使用唑来膦酸扩增的自体 V γ 9V δ 2 T 细胞对治疗难治性 NSCLC 进行过继细胞疗法的 II 期临床试验的结果。 方法 这项开放标签、单组、多中心、II 期研究纳入了已接受至少两种标准化疗方案治疗无法切除的疾病或已接受至少一次包括化疗或放疗治疗术后复发疾病的治疗的 NSCLC 患者。 在初步测试 V γ 9V δ 2 T 细胞增殖后，将自体外周血单核细胞与唑来膦酸和 IL-2 一起培养以扩增 V γ 9V δ 2 T 细胞。每2周静脉注射一次培养细胞（>1×10 9 ），共注射6次。本研究的主要终点是无进展生存期（PFS），次要终点包括总生存期（OS）、最佳客观缓解率（ORR）、疾病控制率（DCR）、安全性和免疫监测。临床有效率定义为中位 PFS 显著 > 4 个月。结果 共入组 25 例患者（20 例腺癌、4 例鳞状细胞癌和 1 例大细胞癌）。25 例患者均接受了自体 V γ 9V δ 2 T 细胞治疗，其中 16 例完成了预定的6次培养细胞注射疗程。中位 PFS 为 95.0 天（95% CI 73.0 至 132.0 天）；中位 OS 为 418.0 天（179.0–479.0 天），最佳总体反应为 1 例部分反应、16 例疾病稳定 (SD) 和 8 例疾病进展。ORR 和 DCR 分别为 4.0%（0.1%–20.4%）和 68.0%（46.5%–85.1%）。9 例患者发生严重不良事件，主要与疾病进展有关。1 例患者因 V γ 9V δ 2 T 细胞输注而出现肺炎和炎症反应，同时伴有巨大肿瘤消失。
高亲和力 CD16 整合到 CRISPR/Cas9 编辑的 CD38 基因座中可增强原代人类自然杀伤细胞的 CD38 定向抗肿瘤活性
摘要 背景 过继转移具有增强的抗体依赖性细胞毒作用 (ADCC) 能力和对 CD38 靶向性抗性的自然杀伤 (NK) 细胞有可能增强达雷木单抗 (DARA) 的临床抗骨髓瘤活性。因此，我们试图开发一种有效的基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑平台，以破坏离体扩增的 NK 细胞中的 CD38 表达 (CD38 敲除 (KO))，并同时为 CD38 KO NK 细胞配备高亲和力 CD16 (CD16-158V) 受体。方法 使用 Cas9 核糖核蛋白复合物生成 CD38 KO 人 NK 细胞。通过结合信使 RNA (mRNA) 转染 CD38 KO NK 细胞和在 CD38 位点插入靶向基因以介导基因敲入 (KI)，扩展了该平台。在体外和 MM.1S 异种移植小鼠模型中测试了这些基因编辑的 NK 细胞在 DARA 存在下持续存在和介导 ADCC 的能力。结果在体外扩增的 NK 细胞中实现了高效的 CD38 基因破坏，而不会影响其增殖或功能能力。CD38 KO 赋予了对 DARA 诱导的 NK 细胞自相残杀的抗性，在体外和 MM.1S 异种移植小鼠模型中，在 DARA 存在下，能够持续存在并增强对骨髓瘤细胞系的 ADCC。CD38 KO NK 细胞可以通过转染编码 CD16-158V 受体的 mRNA 进一步修饰，从而增强 DARA 介导的 ADCC。最后，我们观察到针对 CD38 基因座的同源定向修复模板促进了有效的 2 合 1 CD38 KO 与截短 CD34 报告基因和 CD16-158V 受体的 KI 结合，CD38 KO /CD16 KI NK 细胞在体外和体内均表现出 DARA 介导的 ADCC 的进一步增强。结论使用体外扩增的 CD38 KO /CD16 KI NK 细胞进行过继免疫治疗有可能提高 DARA 的临床疗效。通过将互补的基因工程策略整合到 CD38 KO 制造平台中，我们生成了具有显著增强的 CD38 定向抗肿瘤活性的 NK 细胞，为在临床上探索这种免疫治疗策略奠定了坚实的基础。
使用 CRISPR/Cas9 进行 CBLB 消融可增强人类胎盘干细胞衍生 NK 细胞的细胞毒性，用于癌症免疫治疗
摘要 背景 肿瘤通常会对内源性免疫细胞（包括自然杀伤 (NK) 细胞）的监视产生抗性。离体激活和/或扩增的 NK 细胞对各种肿瘤细胞均具有细胞毒性，是过继性癌症免疫治疗的有前途的疗法。基因改造可以进一步增强 NK 效应细胞活性或活化敏化。在这里，我们评估了泛素连接酶 Casitas B 系淋巴瘤原癌基因-b (CBLB)（一种淋巴细胞活性的负调节剂）的基因缺失对胎盘 CD34 + 细胞来源的 NK (PNK) 细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的影响。方法利用 CRISPR/Cas9 技术在胎盘来源的 CD34 + 造血干细胞中敲除 CBLB，然后分化为 PNK 细胞。在体外表征了细胞扩增、表型和对肿瘤细胞的细胞毒性。在 NOD-scid IL2R gamma 缺失 (NSG) 小鼠的急性髓系白血病 (HL-60) 肿瘤模型中测试了 CBLB 敲除 (KO) PNK 细胞的抗肿瘤功效。评估了 PNK 细胞的持久性、生物分布、增殖、表型和抗肿瘤活性。结果使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术实现了 94% 的 CBLB KO 功效。CBLB KO 胎盘 CD34 + 细胞分化为 PNK 细胞，细胞产量高，纯度 >90%（由 CD56 + CD3 − 细胞身份决定）。CBLB 消融不会影响细胞增殖、NK 细胞分化或 PNK 细胞的表型特征。与未修饰的 PNK 对照相比，CBLB KO PNK 细胞在体外对一系列液体和实体肿瘤细胞系表现出更高的细胞毒性。 CBLB KO PNK 细胞输注到经白消安处理的 NSG 小鼠体内后，表现出体内增殖和成熟，表现为 3 周内 CD16、杀伤性免疫球蛋白样受体和 NKG2A 表达增加。此外，与未修饰的 PNK 细胞相比，CBLB KO PNK 细胞在播散性 HL60-荧光素酶小鼠模型中表现出更高的抗肿瘤活性。结论与未修饰的 PNK 细胞相比，CBLB 消融增强了 PNK 细胞效应功能和增殖能力。这些数据表明，靶向 CBLB 可能通过增强 NK 细胞疗法的抗肿瘤活性提供治疗优势。
隐形转基因使 CAR-T 细胞能够逃避宿主的免疫反应
摘要 背景 过继细胞疗法，例如嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞疗法，已改善血液系统恶性肿瘤患者的治疗效果。目前，FDA 批准的六种 CAR-T 细胞产品中有四种使用基于 FMC63 的 α CD19 单链可变片段（源自鼠单克隆抗体）作为细胞外结合结构域。临床研究表明，患者对自体 CAR-T 细胞的非自身 CAR 成分或同种异体 CAR-T 细胞的供体特异性抗原产生体液和细胞免疫反应，这被认为可能会限制 CAR-T 细胞的持久性和重复给药的成功率。 方法 在本研究中，我们实施了一种一次性方法，通过表达与抗原加工相关的转运蛋白的病毒抑制剂 (TAPi) 结合编码针对 II 类 MHC 转录激活因子 (CIITA) 的 shRNA 转基因，同时减少抗原呈递和两类主要组织相容性复合体 (MHC) 的表面表达，从而防止对工程 T 细胞的排斥。通过流式细胞分析和混合淋巴细胞反应试验在体外筛选出最佳组合，并在白血病和淋巴瘤小鼠模型中在体内进行验证。使用患者样本在自体环境中评估功能，并使用同种异体小鼠模型在同种异体环境中评估功能。结果 Epstein-Barr 病毒 TAPi 和靶向 CIITA 的 shRNA 的组合可有效降低 α CD19“隐形”CAR-T 细胞中的细胞表面 MHC I 类和 II 类，同时保留体外和体内抗肿瘤功能。使用先前接受自体 α CD19 CAR-T 细胞治疗的患者的 T 细胞进行的混合淋巴细胞反应试验和 IFN γ ELISpot 试验证实，表达隐形转基因的 CAR T 细胞可逃避同种异体和自体抗 CAR 反应，这在体内得到了进一步验证。重要的是，我们注意到接受过多次 CAR-T 细胞输注的患者中存在抗 CAR-T 细胞反应，而这种反应在体外用含有隐形转基因的自体 CAR 进行再刺激时会降低。结论总之，这些数据表明，所提出的隐形转基因可能会降低自体和同种异体细胞疗法的免疫原性。此外，患者数据表明，重复剂量的基于 FMC63 的自体 α CD19 CAR-T 细胞可显著增加这些患者的抗 CAR T 细胞反应。