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World File Search System连接酶
FUS在线粒体DNA修复和靶向连接酶-1表达中揭示了FUS连接运动神经元疾病的修复缺失
这项研究确定了融合在线粒体DNA（mtDNA）修复中融合中的生理作用，并突出了其与FUS相关神经退行性疾病的发病机理（如杏仁型侧面硬化症（ALS））的影响。内源性FUS与MTDNA连接酶IIIα（MTLIG3）相互作用并募集到线粒体内的DNA损伤位点，这对于维持健康细胞中MTDNA修复和完整性至关重要。使用ALS患者衍生的FUS突变细胞系，转基因小鼠模型和人尸检样品，我们发现FUS功能损害阻碍了MTLIG3的维修作用，从而导致mtDNA损伤和突变增加。这些改变会导致线粒体功能障碍的各种表现，特别是在与疾病病理学有关的压力状况下。重要的是，在患者衍生的诱导多能细胞（IPSC）中纠正FUS突变可保留mtDNA完整性。类似地，引入人DNA连接酶1的焦油恢复了FUS突变细胞中的修复机制和线粒体活性，这表明潜在的治疗方法。我们发现FUS在线粒体健康和mtDNA修复中的关键作用，为线粒体功能障碍在FUS相关运动神经元疾病中的线粒体功能障碍提供了宝贵的见解。
博士项目建议书
E3 连接酶是一类异质性蛋白质，其生物学复杂且了解甚少，组织表达和活性也各不相同。它们被归类为 HECT（与 E6 相关蛋白 C 端同源）、RING（真正有趣的新基因）或 U-box 蛋白。这三类蛋白在泛素转移机制和蛋白质复合物组成方面有所不同 (8)。由于化学物质的可用性较差，TPD 招募新型 E3 也受到限制。尽管如此，最近的研究表明，几种新型 E3 与 PROTAC 和 MGD 具有活性，包括 DCAF15、DCAF16、KEAP1、RNF4、HERC4 (6,7)，而且该领域正在迅速扩大。E3 连接酶的异常表达和活性通常是癌细胞的特征 (3,5,4)，可用于治疗以产生癌症或组织选择性降解剂。
夏季研究2024/25项目摘要
项目摘要：Xeno核酸（XNAS）是天然出现的RNA和DNA的合成类似物，但其氮基碱，骨干糖单位或磷酸二酯链接的变化。具有不同氮基碱基的XNA通常称为非自然基对（UBP）XNA。UBP只能与自己搭配，而不能与天然出现的碱基对A-T或G-C相对。这有可能通过这些非天然UBP碱基扩大遗传密码并进行合成生物学；但是，这依赖于将其作用于它们的酶的工具。在传统的分子生物学中，我们通常会使用“限制 - 连接克隆”（通常与PCR）一起将新的DNA碎片引入基因组或生产人造DNA。PCR扩大了感兴趣的基因，因此我们有许多副本。然后，我们使用限制性核酸内切酶，该核酸内切酶在DNA中的特定位点识别和切割，从而形成粘合性的悬垂（也称为“粘性端”非正式），可以重新加入。最后，我们使用DNA连接酶密封这些粘性末端，并将所得的DNA引入细胞中。UBPS的问题是酶并不总是识别并使用不自然的碱基工作。为了克服这一点，我们已经测试了一系列核酸酶和连接酶，以剪切和加入UBP-XNA，并找到了两个具有合适活性的核酸酶和连接酶。这些将是您研究的主题。在此项目中，您将组合测试这些酶为：
蛋白质Isgylation：翻译后修饰，对恶性肿瘤的影响
干扰素（IFN）刺激的基因15（ISG15）是由两个泛素样（UBL）结构域组成的15 kDa蛋白。一个铰链序列将N末端UBL结构域连接到C末端UBL结构域，该结构域具有含有赖氨酸，精氨酸和甘氨酸残基（LRLRRGG）的基序[1-4]。通过此序列，ISG15通过E1-激活酶（UBE1L）的顺序作用，E2偶联酶[泛素蛋白 - 偶联酶E2 L6（UBCH8）和E3 liig and rldl rldl rldl rldl and hh3 lig hh 3 ligh酶（ube1l）和rldl rld hhst iSG15与赖氨酸（LYS）残基上的靶蛋白共价相关。泛素蛋白连接酶5（HERC5），Ariadne RBR E3泛素蛋白连接酶1（Hhari）和包含25个（TRIM25）的三方基序[5-8]。此过程称为IsgyLation，以三个步骤发生，类似于蛋白质泛素化过程：（a）UBE1L介导了三磷酸腺苷（ATP）依赖性硫酯与ISG15的形成； （b）ISG15通过式式反应从UBE1L转移到UBCH8，形成ISG15和UBCH8之间的硫酯键； （c）从ISG15-E2酶复合物中，E3连接酶促进了ISG15向靶蛋白的LYS残基的转移和共价附着。因此，e3 ligases herc5，hhari和trim25介导底物的特异性[5-8]。蛋白质Isgylation受调节
基于 PROTAC 的癌症联合疗法
背景 PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）代表了一类有前途的新型药物，可选择性地降解细胞中的目标蛋白质。PROTAC 是具有两个功能端的小分子，一个小分子端与目标蛋白质结合，另一端与 E3 泛素连接酶结合。PROTAC 成分将泛素连接酶募集到目标蛋白质，导致其泛素化并随后被蛋白酶体降解。PROTAC 已被开发用于多种癌症靶标，包括致癌激酶、表观遗传靶标和最近的 KRAS G12C 蛋白，其中几种目前正在临床试验中针对各种癌症进行测试。在临床前癌症模型中已报告对 PROTAC 的获得性耐药性，这表明 PROTAC 疗法对癌症的长期益处可能有限。因此，需要一种能够克服对 PROTAC 的耐药性并提供持久药物反应的治疗方法。发明概述
靶向蛋白质降解药物研发中的关键考虑因素
使用小分子抑制剂针对蛋白质的酶功能以及使用小分子激动剂和拮抗剂针对受体蛋白的功能是小分子药物开发的主要形式。这些小分子调节剂基于传统的占用驱动药理学方法。对于传统上被认为无法被小分子调节剂用药的蛋白质组空间，例如具有支架功能的酶、转录因子和缺乏明确的小分子结合位点的蛋白质，靶向蛋白质降解剂提供了使用事件驱动药理学方法对蛋白质组进行用药的机会。降解分子（PROTAC 或分子胶）将目标蛋白质 (POI) 和 E3 泛素连接酶拉近并与泛素-蛋白酶体系统 (UPS)（用于降解 POI 的细胞废物处理系统）结合。为了开发靶向蛋白质降解剂来满足治疗需求，将从几个方面考虑，即致病蛋白质的选择性降解、超出 Lipinski 五规则 (bRo5) 范围的降解剂的口服生物利用度、新的 E3 泛素连接酶和分子胶降解剂的需求以及新药物模式的耐药性。本综述将说明靶向蛋白质降解药物发现和开发中几个未被充分讨论的关键考虑因素：1）影响 PROTAC 分子选择性的因素以及 PROTAC 的设计以选择性降解协同病理蛋白质；2）结合多组学方法开发检测方法，以鉴定新的 E3 连接酶及其相应的配体以及分子胶降解剂；3）分子设计以提高 bRo5 PROTAC 的口服生物利用度；4）降解剂的耐药性。
HiHo-AID2：提高纯合敲入效率可实现人类生长素诱导的降解细胞的强劲生成
背景 生长素诱导降解 (AID) 技术可通过化学遗传学控制蛋白水解 [ 1 ]。为了应用 AID，需要通过基因工程将不稳定肽或“降解决定子”标记到目标蛋白上。生长素受体（如 Os TIR1）在相同细胞中外源表达，作为 Skp1-Cullin1-TIR1 (SCF TIR1 ) 泛素连接酶复合物的底物识别亚基发挥作用。生长素（如吲哚-3-乙酸，IAA）作为化学胶水连接 SCF TIR1 泛素连接酶和降解决定子标记蛋白，导致降解决定子标记蛋白快速多泛素化和蛋白酶体降解 [ 1 , 2 ]。 AID 能够快速高效地降解靶蛋白，避免长期沉默或 CRISPR 敲除过程中出现的副作用，并为理解动态生物过程中不同靶蛋白的功能提供了重要的机制见解 [ 3 – 7 ]。然而，一些障碍限制了我们充分发挥 AID 潜力的能力。
PROTAC 药物发现的计算策略
蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 是一种用于潜在临床药物发现的新型靶向蛋白质降解技术，由蛋白质靶向配体与 E3 连接酶配体共价连接而成。通过招募 E3 连接酶到靶蛋白，PROTAC 通过泛素-蛋白酶体系统引发泛素化并随后降解靶标。在过去的几十年中，分子对接和虚拟筛选已经成为一种有效的药物发现策略，用于从大量化学结构数据库中识别化合物。对于 PROTAC，分子对接可以准确模拟蛋白质-PROTAC-E3 三元复合物，从而大大加速构效关系分析，并提高配体的亲和力和选择性。在本综述中，我们总结了分子对接和虚拟筛选在 PROTAC 药物发现中的应用的最新进展。迄今为止，已有大约 9 种靶蛋白和 12 种 PROTAC 成功通过分子对接和虚拟筛选开发。最后，讨论了分子对接和基于虚拟筛选的 PROTAC 的潜在挑战。
构建重组 DNA 分子的方法。
概述：TOPO TA 是标准 TA 克隆的一种改进方法，使用酶拓扑异构酶 I。该技术使用酶拓扑异构酶 I 催化 PCR 产物连接到专门设计的载体中。优点：高效快速，无需限制酶或连接酶。局限性：相对昂贵；仅限于拓扑异构酶特异性载体。
SUMO1的泛素化和小分子降解器的降解扩展了小鼠的存活率
发现了激活泛素连接酶介导的泛素化和在癌细胞中靶向癌蛋白的泛素化和降解的小分子降解者一直是一种难以捉摸的治疗策略。在这里，我们报告了基于NCI药物的化合物库的基于癌细胞的药物筛选，该筛选能够鉴定与泛素蛋白相关的小子相关修饰剂1（SUMO1）的小分子降解器（SUMO1）。命中化合物CPD1的类似物的结构活性关系研究导致识别具有改善性能和体外和体内抗癌效力的铅化合物HB007。基因组尺度CRISPR-CAS9敲除屏幕确定了Cullin 1（Cul1）E3泛素连接酶的底物受体F-box蛋白42（FBXO42），这是HB007活性所需的。使用HB007下拉蛋白质组学测定法，我们将HB007的结合蛋白作为细胞质激活/增殖相关蛋白1（caprin1）。Biolayer干涉法和复合竞争性免疫印迹测定法证实了HB007与Caprin1的结合的选择性。与caprin1结合时，HB007诱导caprin1与FBXO42的相互作用。fbxo42然后将SUMO1募集到Caprin1-Cul1-FBXO42泛素连接酶复合物，其中SUMO1在几个人类癌细胞中泛素化。HB007在植入小鼠中的患者肿瘤衍生异种移植物中有选择性降解SUMO1。全身施用HB007抑制了小鼠中患者衍生的大脑，乳腺癌，结肠和肺癌的进展，并增加动物的存活率。这种基于癌细胞的筛查方法使发现了SUMO1的小分子降解器，并且可能有助于识别其他小分子降解剂的其他小分子降解器。