摘要DNA甲基化对仓鼠腺嘌呤磷酸蛋白酶基转移酶(APRT)和疱疹胸苷激酶(TK)基因的跨遗传活性的影响。通过使用包含这些基因序列的M13构建体,使用限制性片段启动引物第二链合成在体外甲基化的特定段使用底物2'-脱氧-5-甲基-5-甲基 - 胞迪三丁烷三磷酸(DMCTP)。通过DNA-MEDI-ETED共转移将这些杂交甲基化分子插入小鼠LTK细胞中。在所有情况下,整合序列都保留了体外定向的甲基化模式。在5'区域中CpG甲基化抑制了APRT基因,但在3'端或相邻的M13序列中未能通过甲基化来进行。与此相反,在5'启动子区域和TK基因的3'结构区域中的DNA甲基化都具有很强的抑制作用。这表明这种修饰可能会通过不涉及RNA聚体识别序列直接改变的机制影响转录。
crispr-cas9对于包括模型植物Phantcomitrium patens在内的植物中的基因组编辑非常有价值。然而,使用天然Cas9核酸酶进行的大多数编辑事件对应于小插入和缺失,这一事实是一个限制。CRISPR-CAS9碱基编辑器使真核基因组中的单核苷酸的靶向突变,因此克服了这一限制。在这里,我们报告了两个可编程基础编辑系统,以在p中诱导精确的胞嘧啶或腺嘌呤转化。patens。使用胞嘧啶或腺嘌呤碱基编辑器,可以使用高达55%的效率来实现位点特异性的单基碱基突变,而无需脱离靶向突变。使用APT基因作为编辑的记者,我们可以证明两个基本编辑器都可以在单纯形或多重编辑中使用,从而可以生产具有多种氨基酸变化的蛋白质变体。最后,我们设置了一个共同编辑的选择系统,命名为APRT的修改以报告基因靶向(SMART),最多可在p中进行效率高达90%的效率位点基础编辑。patens。这两个基本编辑者将促进p中的基因功能分析。patens,可以通过单个SGRNA碱基编辑或使用多个SGRNA碱基编辑来生产随机诱变的变体来通过单个SGRNA碱基编辑或用于给定基因的植物学演化进行定位编辑。
单基因疾病通常是特定基因单点突变的结果,导致非功能蛋白的产生。不同的血液疾病,例如β-丘脑贫血,镰状细胞病,遗传性球细胞增多症,fanconi贫血和血友病A和B,通常是由点突变引起的。基因编辑工具,包括Talens,ZFN或CRISPR/CAS平台,以纠正负责不同疾病的突变。然而,不依赖核酸酶活性的替代分子工具,例如形成三核苷酸及其衍生物(例如肽核酸),也证明了它们在DNA中纠正突变的能力。在这里,我们回顾了修复 - 螺肽反向Hoogsteen发夹(PPRHS)技术,该发夹可以代表该领域内的替代基因编辑工具。修复-PPRHS是由由五甲状腺素桥连接的两个息肉素镜重复序列形成的单链DNA分子,然后在分子的一端进行扩展序列,该序列是与DNA序列同源的,但要修复了DNA序列,但含有修复的DNA序列。PPRH的两个息肉臂由嘌呤之间的分子内反间隔键结合,从而形成了发夹结构。该发夹芯与watson-crick键以序列特异性方式与dsDNA中靶突变相对近乎近距离突变结合,从而产生了刺激重组的三重结构。这项技术已成功地用于修复其内源性基因座中DHFR和APRT基因突变体在哺乳动物细胞中的集合,并且可以适合校正负责血液疾病的突变。