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丰富的植物生长 - 促进促进和生物 -
土壤维持生物生产力的潜力（被定义为土壤健康）受到人类活动（例如农业）的强烈影响。因此，必须找到土壤管理的可持续农业和新方法，这些新方法必须找到土壤健康和作物产量。使用微生物接种剂的生物铜质化成为了常规干预措施（例如过量矿物质受精和除草剂使用）的有希望的替代方法。用作生物动力农业的中心部分的生物动力制剂对土壤特性（例如微生物生物量和呼吸）具有各种影响。我们进行了几个生物标志物实验，以推断生物动力制剂对土壤原核和真菌群落的影响，并将结果与有机管理进行了比较。潜在的植物生长促进扩增子序列变体使用基于其分类学身份的商业数据库进行定量。我们发现，与有机处理的土壤相比，在生物动力学中促进了假定的植物生长数量更高。此外，在生物动力学的土壤中发现了富含生物动力学制剂的核肿瘤扩增子序列变体，表明治疗后成功定植。在德国的三个地点和法国的21个地点进行了实验，涵盖了不同的农作物和土壤类型。总的来说，我们的结果表明，生物动力制剂可以充当生物肥料，从而通过增加植物生长促进微生物的丰富度来促进土壤健康。
23-023-02cr：请求
利用选择标记鉴定转化植物，并筛选 T-DNA 拷贝数。通过扩增子测序鉴定编辑的 T0 植物（Clement 等人，2019 年；Illumina MiSeq 系统指南，2018 年；Illumina MiSeq 系统指南，2019 年），自交，并通过扩增子测序分析所得的 T1 植物以确认编辑。进行了额外的 PCR 检测，以确认不存在 T-DNA 插入物和质粒骨架（Applied Biosystems 用户公告 #2）。选择包含所需编辑但没有 T-DNA 或质粒骨架的纯合 T1 植物 P227933.30 进行延续，并将其命名为 GM200007。T1 植物不含外来 DNA，在 [ ] 基因中含有纯合缺失。表 1. 用于创建 GM200007 大豆的转化载体 F137620 的遗传元件
补充方法 DNA 分离 ...
补充方法 DNA 分离 使用自动 DNA 提取仪按照其协议（chemagic MSM I，PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）从血液样本中分离 DNA。 使用试剂盒“EZ1&2 DNA Tissue”（Qiagen，德国希尔登）按照协议使用自动 DNA 提取仪 EZ1 Advanced XL（Qiagen）从羊膜细胞和绒毛中分离 DNA。 染色体微阵列（CMA） 使用 SureTaq DNA 标记试剂盒（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）标记 DNA，并根据制造商的说明在 GenetiSure Cyto 4x180K CGH 微阵列（Agilent）上进行杂交。使用 InnoScan 910 AL 扫描仪（Innopsys，Carbonne，法国）扫描载玻片，并使用分析程序 Mapix（Innopsys）和 CytoGenomics 版本 5.1.2.1 和 5.3.0.14（Agilent）进行处理。使用参考基因组 GRCh38 评估数据。染色体分析和荧光原位杂交使用标准方法从肝素血样以及绒毛和羊膜细胞培养物中进行中期制备。简而言之，将来自肝素血样的细胞培养在含有植物血凝素作为有丝分裂原的 LymphoGrow 培养基（CytoGen，Sinn，德国）中，羊膜细胞培养在 Amniogrow plus 培养基（Cytogen，Sinn，德国）中，CVS 细胞培养在 Chang 培养基 D（Fujifilm，Minato，日本）中。固定后，将中期细胞滴到载玻片上，然后在 60 °C 下干燥过夜。使用核型分析系统 Ikaros（MetaSystems，德国阿尔特鲁斯海姆）通过 GTG 显带评估中期染色体的扩散情况。对于 FISH 分析，使用 Empire Genomics（美国纽约州布法罗）的探针 RP11-213E22-green 和 RP11-577D9-orange（7 号染色体）以及 RP11-358H10-green 和 RP11-241M19-orange（16 号染色体）。所有探针均按照制造商的说明使用。使用 Isis 数字成像系统（Metasystem Inc.，德国阿尔特鲁斯海姆）分析图像。 PCR 和测序 在适用的情况下，确认并进一步指定 OGM 分析中的断点，方法是使用 MinION 测序仪（Oxford Nanopore，英国牛津）进行第三代长距离测序，或使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行 Sanger 测序。引物是根据 Dremsek et al., 2021 中描述的策略设计的。为了将引物定位得尽可能靠近预期的断点，OGM 数据和 CMA 数据都融入了其设计中。为了分析P1，进行了长距离PCR（连接点B/D*的扩增子：正向引物：5'-ggaggacaattttatcccccaggg-3'和反向引物：5'-gtgagccgtgagtttgccactat-3'；连接点D*/B*的扩增子：正向引物：5'-tcgttgacggtgaaatgctacgt-3'和反向引物：5'-gcagataacggagtgaggaaggc-3'）。PCR扩增后，使用引物 5' -acagctcactatagcagataggtgt- 3'、5' - ttgcatcaggaacatgtggacct- 3'、5' -ctggtcacaggcgcaaatcaaag- 3'、5' -gtcagcaaaggagagaagcagct- 3' 和 5' - gcaggttggctctttcccaagta- 3' 制备连接点 B/D* 的扩增子（大小为 4 kbp）进行 Sanger 测序。使用引物 5' -agggaaaagagatgtgtaaaatactgt- 3', 5' -agatgaggaagggcatctgac- 3', 5' -tcaagttgtcattgtggtgaatt- 3', 5' - cagatgccagcgctaagacgat- 3', 5' -aggttattacacacccctcct- 3', 5' -tgttcattatcactggccatcaga- 3', 5' -aaggggaaacctcctgctactct- 3', 5' - tgcacccactaacgtgtcatcta- 3', 5' -gggttggttccaagtctttgcta- 3', 5' -gctgaaactggatcccttcctta- 制备连接点 D*/B* 的扩增子（大小为 13 kbp），进行 Sanger 测序。 3'、5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动槽上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动池上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动池上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。
使用重组 Cas9 核酸酶评估基因组编辑实验中的位点修饰的方案
简介 用 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 核酸酶) 体外消化 PCR 扩增子是一种灵敏的插入/缺失检测方法。与错配检测方法不同，Cas9 还具有确定 50% 以上靶向效率的额外优势。这很有价值，因为基因组编辑实验中的靶向效率提高了，并且可用于检测分离的细胞群落或组织中的双等位基因编辑，而以前只能使用专门的 PCR 或扩增子测序方法来实现。
博士计划动物和食品科学课程（如果预见）
奖学金的类型EX DM 630/2024 NGS在野生和耕种工厂中的赋予培训概况，主管Piergiorgio Stevanato主管发送电子邮件至stevanato@unipd.it项目描述背景，背景是16S和目标的Amplicon测序的应用，是支持高级繁殖和繁殖的有前途的工具。但是，我们对植物相关微生物群落的理解仍然有限。目的该项目旨在使用16S rRNA及其测序方法分析不同生长野生和栽培植物的微生物多样性的季节变化。材料和方法将使用16S rDNA多样化学测序评估细菌多样性，同时将使用其目标的扩增子测序来调查真菌群落多样性。ITS1和ITS2区域将用于分析。预期的结果将揭示使用NGS的野生和栽培植物之间的内生谱差异。以检测叶片菌群组成的变化和随着季节在不同采样时间的发展而变化的丰富度。确定影响细菌和真菌群落组成的环境和遗传因素。为植物的微生物分析提供了关键的见解，讨论对精确表型和农作物繁殖的影响。强制性实习生
动植物科学在HIFI测序
所有样品吞吐量均为使用1个SMRT Cymist的VEGA系统的VEGA系统的估计值，使用1 SMRT细胞的SPRQ化学。覆盖范围可能会根据样本质量，图书馆质量和片段长度而有所不同。当前可用的SMRTBELL®适配器索引板96A-96D总共包含384个SMRTBELL条形码适配器。微生物从头组装假定的微生物为2 GB的总基因组大小为每个样品30倍。单细胞转录组学在Revio系统上的每个库中≥8000万次读取，在VEGA系统上的每个库中约有500-6亿个读取。全长RNA测序假设Revio Sprq的总读数为60m，而Vega的30m读取，无论有何plexity。Amplicon测序假设电影时间为1-5 kb的12小时电影时间，24小时的电影时间为5+ kb，每个样本> 50倍。目标富集假设每个样品> 50倍。
通过先进的原型技术探索安第斯高海拔湖泊极端微生物
摘要：快速鉴定和表征来自极端环境的分离物目前是一项挑战，但对于探索地球的生物多样性却非常重要。由于这些分离物原则上可能与已知物种有远亲关系，因此需要采用技术来可靠地鉴定它们所属的生命分支。通过串联质谱法对这些环境分离物进行蛋白质分型提供了一种快速且经济有效的方法，可以使用它们的肽谱进行鉴定。在本研究中，我们记录了第一种用于环境嗜极菌和嗜盐菌分离物的高通量蛋白质分型方法。微生物是从智利高原高海拔安第斯山脉湖泊（海拔 3700 - 4300 米）的样本中分离出来的，这些湖泊代表的地球环境与其他星球的条件相似。总共培养了 66 种微生物，并通过蛋白质分型和 16S rRNA 基因扩增子测序进行了鉴定。两种方法对所有分离物都揭示了相同的属鉴定结果，但三种分离物除外，这三种分离物可能代表尚未根据其肽组进行分类学表征的生物。蛋白质分型能够表明副球菌科和 Chromatiaceae/Alteromonadaceae 科中存在两个潜在的新属，而这些属仅被 16S rRNA 扩增子测序方法所忽略。本文强调，蛋白质分型有可能发现来自极端环境的未描述的微生物。关键词：串联质谱蛋白质分型、阿塔卡马沙漠、高原、高海拔安第斯山脉湖泊、极端微生物、嗜盐菌■简介
评估和优化从附生植物学样品中提取微生物DNA的裂解方法
分析附生植物圈中的微生物群落可能具有挑战性，尤其是在应用基于测序的技术时，由于植物来源的生物分子（例如核酸）的干扰。对附生微生物组的最新研究的综述表明，机械和酶促方法都广泛使用。在这里，我们评估了两种裂解方法对DNA提取产率，纯度，完整性和微生物16S rRNA基因拷贝数在不同提取条件下的每种模板基因组DNA的影响。此外，使用16S rRNA基因扩增子测序研究了对细菌群落组成，多样性和可重复性的影响。酶促裂解方法产生的DNA增加了一到两个数量级，但DNA质量是次优的。相反，使用Me-Chanical方法制备的样品显示出高的DNA纯度，尽管产量较低。出乎意料的是，机械裂解显示出比酶裂解更高的DNA完整性数（DIN）。16S rRNA扩增子测序结果表明，通过机械破坏制备的样品表现出可重复的相似的微生物群落组成，无论提取条件如何。相比之下，酶促裂解方法在不同的提取条件下导致分类学组成不一致。这项研究表明，机械DNA破坏比酶促破坏更适合附生层样品。
DNA甲基化分析DPCRDNA甲基化分析DPCR
高-GC区域（例如RASSF1A启动子）的扩增通常效率低下，即使在未甲基化的区域中也是如此（请参阅下图中图中的第一组数据；测试的GC的GC含量为72％GC）。这可能会使不论甲基化状态如何准确量化模板的数量。然而，在使用DigitalLightCycler®DPCR系统时，将高GC增强子添加到扩增反应中可以显着提高放大效率和定量准确性（请参见下文）；这增加了基于DPCR的DNA甲基化分析的灵敏度和准确性。
多重连接依赖性探针扩增（MLPA）
大小标准由已知长度的荧光标记 DNA 片段组成，可作为分子标尺。大小标准标记的荧光染料与 MLPA 探针产品不同。当片段根据大小迁移时，毛细管电泳仪中的检测器会检测到大小标准和 MLPA 扩增子的荧光 - 小片段比大片段通过得更快。将每个 MLPA 扩增子的迁移与大小标准的每个片段的迁移进行比较，以确定大小，从而确定 MLPA 扩增子的身份。