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21k06020研究结果报告
研究成果の概要（英文）：在这项研究中，我们试图开发关键技术，以建立一种方法来通过将CRISPR-CAS9，组蛋白修饰识别域和双分子荧光互补（BIFC（BIFC）相结合，以跟踪活细胞中组蛋白修饰的时空动力学。我们测试了一个称为GFP-clamp的新分子，该分子延迟了GFP衍生的荧光蛋白的光漂白，从而增强了活细胞成像的时间分辨率。我们开发了一种使用单链DNA结合蛋白RFA1评估引导RNA的体内功能的方法，该方法可以有效评估CRISPR-CAS系统中指南RNA的功效。
分析城市能源以实现净零能源社区
在转基因作物中表达的外源蛋白的细胞定位不仅决定了其稳定性，而且还决定了它们对作物生长和发育的影响，包括在压力条件下；然而，潜在的分子机制仍然未知。在这里，我们通过亚细胞定位，免疫组织化学，免疫流畅和蛋白质印迹分析确定了抗昆虫的转基因水稻huahui-1（HH1）细胞中外源表达的Cry1Ab/c蛋白的细胞分布。通过酵母两杂交，双分子分子荧光互补（BIFC）和辅助药物分析研究了CRY1AB/C蛋白与初筛选的内源性质膜Ca 2+ ATPase之间的相互作用。通过比较CRY1AB/C和Ca 2+ ATPase之间的细胞定位和相互作用位点分析了潜在的相互作用机制。表型指数和Ca 2+ -ATPase活性在转基因HH1和父母线Minghui-63在无压力和盐压力的条件下确定，可以由CRY1AB/C-Ca 2+ -ATPase相互作用调节。结果表明，Cry1ab/C不仅分布在细胞质和核中，而且还分布在质膜上，在质膜上与质膜Ca 2+ -ATPase相互作用。通过BIFC实验，这种相互作用部分保留了细胞核中的质膜蛋白Ca 2+ ATPase，因此可能会通过改变蛋白质的细胞位置来影响膜上Ca 2+ -ATPase活性。一致地，我们的结果证实了转基因HH1中Cry1ab/c的存在导致Ca 2+ -ATPase活性的降低，并对植物表型造成不利影响，包括显着降低的植物高度和生物量，与亲属MH63相比；并且这些有害作用在盐应力条件下更明显，从而影响转基因
A 14-3-3蛋白Ca16r通过与CAASR1
摘要：尽管14-3-3蛋白与植物的生长，发育和压力反应有关，但它们在胡椒免疫中的作用仍对茄肠杆菌的作用仍然很少了解。在这项研究中，发现在胡椒中14-3-3编码的基因Ca16r，被发现由溶藻菌接种（RSI）上调（RSI），其沉默显着降低了胡椒植物对RSI的抵抗力，并且其过表达显着增强了Nicotiana benthamiana对RSI的抵抗力。一致地，其在胡椒叶中的短暂过表达触发了HR细胞死亡，表明它在针对RSI的胡椒免疫中起作用，进一步发现它可以通过促进SA来抑制JA信号，以对RSI的Pepper免疫呈阳性。Ca16r与CAASR1相互作用，最初使用频谱测定法结合使用，然后使用双分子荧光互补（BIFC）和下拉测定法确认。此外，我们发现CAASR1瞬时过表达在抑制JA信号传导的同时诱导HR细胞死亡和SA依赖性免疫，尽管这种诱导和抑制被CA16R沉默阻止。所有这些数据表明，CA16R通过与CAASR1相互作用而在针对RSI的辣椒免疫中起作用，从而在抑制JA信号传导的同时促进了SA介导的免疫力。这些结果提供了对针对RSI免疫力的基础机制的新见解。
岩石栖息菌 Knufia petricola 的基因工程为极端耐受性黑真菌的生物学提供了见解
黑色微菌落真菌（来自 Arthonio-、Dothideo- 和 Eurotiomycetes 的子囊菌）是自然和人为极端栖息地中耐压力和持久的栖息者。它们表现出缓慢的酵母样或分生生长，不形成专门的生殖结构，并在多层细胞壁中积累黑色素 1,8-二羟基萘 (DHN) 黑色素。要了解黑色真菌如何生活、存活、在矿物基质上定殖以及与光养菌相互作用，需要使用遗传方法来测试这些功能和相互作用。我们选择了 Chaetothyriales 的岩石栖息菌 Knufia petricola 作为开发遗传操作方法的模型。在这里，我们报告了通过更高效的多重 CRISPR/Cas9 扩展遗传工具包的情况，使用基于质粒的系统表达 Cas9 和多个 sgRNA，并实施三个抗性选择标记 genR（遗传霉素/ nptII）、baR（草铵膦/ bar）和 suR（氯嘧磺隆/ sur）。通过替换色素合成必需基因有针对性地整合表达构建体，可以对转化体进行额外的颜色筛选。由于消除了 pks1（黑色素），黑粉色筛选被用于启动子研究，使用 GFP 荧光作为报告基因。由于同时消除了 pks1 和 phs1（类胡萝卜素），黑白筛选可以识别包含两个表达构建体的转化体，以进行共定位或双分子荧光互补 (BiFC) 研究。证实了两种 K. petricola White Collar 直系同源物的共定位和相互作用。确定了两个基因间区域 ( igr1 、 igr2 )，其中可以插入表达构建体而不会引起明显的表型。使用 pNXR-XXX 系列质粒和新的兼容入门质粒可以快速轻松地生成表达构建体，适合在其他真菌中广泛实施。这种遗传工具的多样性为黑真菌基因组编码的基因/蛋白质的表达、功能和调控的机制和非常详细的研究开辟了一个全新的视角。