Legenda讲座:讲座地点(教室A,计算机教室)在LJ Jamnikarjeva 101,LJ的农艺学系生物技术学院。b,位于LJ的永恒路线生物学系生物技术学院。,其中一个大型演讲室位于LJ Hajdrihova 19的化学研究所。fri,位于LJ的《永恒之路》 111号计算机和信息科学学院。
为确定注射体积对聚集体的检测以及聚集体和单体之间的分辨率,分析了从0.5 µL到2.0 µl的四个AAV血清型(AAV2、5、5、8和9)之间的体积(图1-4)。在所有注射量下,AAV2和AAV8的单体和聚集体之间的分辨率≥2.0(图1和3)。AAV5和AAV9(图2和4)显示所有注射体积的分辨率在1.5至2.0之间。有趣的是,随着注射体积从0.5 µL增加到2.0 µL,AAV9的分辨率从1.6提高到2.0。在所有血清型中,在注射体积中的总百分比保持一致,这表明与高度敏感的荧光检测器耦合生物Zen DSEC-7色谱柱的高效率,可在低至0.5 µL的注射下提供准确的检测和分离。
5.1。反应缓冲液5x B7反应缓冲液包含:15 mM MGCL 2,5 mm DNTPS,增强剂和稳定器。我们不建议添加进一步的单独的PCR增强剂(例外请参见5.3)或MGCL 2。5.2。引物引物应使用默认引物3设置(https://bioinfo.ut.ee/primer3/)具有预测的熔点约为60°C。反应中的最终引物浓度应在0.2μm和0.6μm之间。5.3。10倍增强子长模板,富含GC的模板或具有复杂二级结构的模板:如果没有或弱扩增的添加10x B7增强子可以提高产量。5.4。退火使用的退火温度等于下TM引物的TM。如果存在非特异性产品,则以2°C的增量增加。或者使用温度梯度在实验中找到最佳的退火温度。5.5。扩展E Xtension应在72°C下进行。最佳延长时间取决于模板的扩增子长度和复杂性。我们建议大多数模板的延长时间为30秒(KB)。在2步协议的情况下,68至75°C可以用作结合退火/延长温度。5.6。多路复用PCR首次执行多重PCR时,建议在计算出的退火温度周围运行温度梯度。在随后的实验中应使用代表最佳特异性的退火温度。不应使用快速循环条件。最初建议使用最长片段的延长时间。
* 温度限制取决于方法运行参数。建议这些 Biozen LC 色谱柱的最高温度为 90 °C,但温度限制取决于您的运行参数。在 pH 大于 8 和高温下运行将缩短色谱柱寿命。在最高温度限制下连续使用 Biozen 色谱柱可能会缩短色谱柱寿命。** 梯度条件下 pH 范围为 1.5 - 9。等度条件下 pH 范围为 1.5 -10。*** 梯度条件下 pH 范围为 1.5 - 8.5。等度条件下 pH 范围为 1.5 -10