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可编程双 RNA 引导的 DNA 内切酶...
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统通过使用 CRISPR RNA (crRNA) 引导入侵核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。我们在此表明，在这些系统的一个子集中，与反式激活 crRNA (tracrRNA) 碱基配对的成熟 crRNA 形成双 RNA 结构，该结构指导 CRISPR 相关蛋白 Cas9 在靶 DNA 中引入双链 (ds) 断裂。在与 crRNA 引导序列互补的位点，Cas9 HNH 核酸酶结构域切割互补链，而 Cas9 RuvC 样结构域切割非互补链。当双 tracrRNA:crRNA 被设计为单 RNA 嵌合体时，它还会指导序列特异性 Cas9 dsDNA 切割。我们的研究揭示了一个使用双 RNA 进行位点特异性 DNA 切割的核酸内切酶家族，并强调了利用该系统进行 RNA 可编程基因组编辑的潜力。B
2020；8：30-36。doi：10.7150/jgen.43928 研究论文利用 Cas13a 进行可编程 CRISPR 干扰，实现蚊子基因沉默
在 CRISPR-Cas 系统中，Cas13a 是一种 RNA 引导的 RNA 核酸酶，专门靶向单链 RNA。我们开发了一种 Cas13a 介导的 CRISPR 干扰工具，以靶向 mRNA 来实现蚊子的基因沉默。通过胸内注射将表达 Cas13a 的质粒递送给蚊子，递送后至少 10 天仍可检测到 Cas13a 转录本。使用 T7 RNA 聚合酶在体外合成靶向特异性 crRNA。Cas13a 质粒和靶向 crRNA 可以通过胸内注射一起递送，或者可以先提供 Cas13a 构建体，然后在适当的时候提供靶向 crRNA。在两种蚊子中测试了该机制。在冈比亚按蚊中，卵黄蛋白基因被 Cas13a/Vg-crRNA 沉默，同时伴有产卵量显著下降。在埃及伊蚊中，COPI 基因的 α 和 δ 亚基被 Cas13a/crRNA 沉默，导致死亡和中肠脆弱，重现了之前报道的表型。当提供目标 crRNA 混合物时，可以同时实现基因共沉默。研究中未观察到非目标转录本的可检测的附带切割。除了 dsRNA 或 siRNA 介导的 RNA 干扰外，可编程的 CRISPR 干扰方法提供了一种在蚊子中敲除基因的替代方法。
自适应细菌免疫中的可编程双 RNA 引导 DNA 内切酶
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统通过使用 CRISPR RNA (crRNA) 引导入侵核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。我们在此表明，在这些系统的一个子集中，与反式激活 crRNA (tracrRNA) 碱基配对的成熟 crRNA 形成双 RNA 结构，该结构指导 CRISPR 相关蛋白 Cas9 在靶 DNA 中引入双链 (ds) 断裂。在与 crRNA 引导序列互补的位点，Cas9 HNH 核酸酶结构域切割互补链，而 Cas9 RuvC 样结构域切割非互补链。当双 tracrRNA:crRNA 被设计为单 RNA 嵌合体时，它还会指导序列特异性 Cas9 dsDNA 切割。我们的研究揭示了一个使用双 RNA 进行位点特异性 DNA 切割的核酸内切酶家族，并强调了利用该系统进行 RNA 可编程基因组编辑的潜力。B
使用 Dharmacon Edit- 对斑马鱼胚胎进行显微注射……
图 1：微注射 Edit-R Cas9 核酸酶 mRNA 和合成 crRNA:tracrRNA 的斑马鱼胚胎具有可检测的编辑事件。仅微注射 Edit-R Cas9 mRNA（+/+ 泳道）或微注射 Edit-R Cas9 mRNA 加靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA（+ 泳道）。注射后 2 天制备基因组 DNA，并使用位于切割位点两侧的引物进行 PCR。使用 T7EI 进行 DNA 错配分析，并在 2% 琼脂糖凝胶上分离样品。使用 ImageJ 软件估计由于基因编辑而导致的插入和缺失百分比 (Indel %)，并显示在泳道底部。在所分析的斑马鱼胚胎中，75% 实现了使用靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA 编程的 Cas9 mRNA 的靶向 DNA 切割。
新型 CRISPR 工具在心血管研究和医学中的应用
基因组编辑技术的发展彻底改变了生物医学研究，特别是自从 CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9）技术引入以来。该系统最初是在细菌免疫反应中发现的 1，随后应用于真核生物基因组编辑 2 – 4。CRISPR/Cas9 系统的简单性使基因组编辑比传统的 DNA 编辑技术更容易获得和更容易。作为一种基因组编辑工具，该系统由两个基本成分组成：一种切割 DNA 链的内切酶 Cas9，以及一种单向导 RNA（sgRNA），其中包含用于识别目标 DNA 区域的特定序列。值得注意的是，细菌中的内源性 Cas9 系统有两种 RNA 成分（CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 crRNA）； CRISPR/Cas9 工具中的 sgRNA 是由 crRNA 和反式激活 crRNA 人工改造而成。当 Cas9 和 sgRNA 被递送到细胞中时，产生的 Cas9-sgRNA 复合物被导向目标基因组位点，在那里产生 DNA 中的双链断裂 (DSB)。然后通过内源性 DNA 修复机制修复 DSB，从而实现基因敲除或敲入 5 。
第 1 类 CRISPR-Cas 系统：基因组工程……
新的间隔物被整合到宿主的 CRISPR 阵列中。 CRISPR 阵列通常在重复的 DNA 片段之间具有许多不同的间隔物，即重复序列 [3]，CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）由此得名 [4]。 CRISPR 阵列的转录和前体转录本的加工产生成熟的 CRISPR RNA（crRNA），每个 crRNA 含有一个间隔区和部分重复序列（图 1，[5]）。与crRNA间隔区具有碱基互补的DNA分子被CRISPR-RNP（crRNP）特异性识别和结合，不仅介导对环境中外来DNA的防御，而且还为我们的修改和调控基因和基因组提供了多种可能性。 CRISPR-Cas 系统分为两类：更常见的第 1 类使用来自几种 Cas 蛋白的 crRNP，
22K15029研究结果报告
表格C-19，F-19-1，Z-19（常见）1。初步研究的背景申请人设计了一个人造的CRIS-CAS9裂解序列（Syn-CrRNA目标序列）（Syn-CrRNA-TS（合成CRRNA目标序列），该序列（合成CRRNA目标序列）最小化对小鼠和人类基因组的推动力最小化，并开发了一种多功能供体质粒（PCRIMGET）的质体统一的构造，多竞争站点（MCS）的两端。Sci
用于养殖动物繁殖的基因组...
图3。CRISPR/CAS9系统机制6。a）外国DNA序列的破坏。在反对病毒和血浆的斗争中，CRRNA识别出异物DNA的原始探针系列，并与近距离PAM系列有关。tracra改善了CRRA与相应的DNA序列的结合，从而通过与Cas9核的关系触发了双码分裂对CRRA。双重婚礼师特定于该地区，如黑色箭头所示，PAM阵列发生在3个基对上方。b）crıspr / cas系统识别基因组DNA中的靶序列的GRNA（Kimre of CrRNA和Trocrocrna的Kimre），具有相邻的PAM序列，并通过CAS9的复杂形成和诱导靶DSB的复杂形成而激活。下一个DNA修复可用于以后编辑基因组。
CRISPR 基因组编辑的最佳解决方案 - Bioneer Corporation
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）- Cas9 基因组编辑工具源自微生物组的适应性免疫系统，可切割目标 DNA 区域并允许 DNA 自然修复。它也被称为“RGENs”（RNA 引导的工程化核酸酶），因为它由 gRNA（向导 RNA）和 Cas9 核酸酶组成。该技术为精确操作基因组提供了更简单、更有效的方法。gRNA 由 crRNA 和 tracrRNA 组成。crRNA 具有 20 nt 的靶标互补序列，而 tracrRNA 具有 Cas9 结合所需的识别序列（图 1）。
tfg_carlafernándezálvarez.pdf
图2。 div>与II型CRISPR-CAS系统功能相对应的三个阶段的方案。 div>在采集阶段，入侵者DNA（红色）越过细菌壁，并立即被CAS蛋白（Cas1和Cas2用两个蓝色圆圈代表）起诉。 div>接下来，将入侵者DNA片段作为原始效应（s = proto -Sprater; r =重复）集成到CRISPR基因座中。 div>表达的第二阶段开始，在该阶段通过获得将通过III型RNASA处理的前crrna来转录CRISPR基因座。 div>随后的分裂后，crrna复合物：TrcRNA获得了核酸内切酶Cas9的结合。 div>以这种方式，crrna络合物：trcRNA：cas9已准备好在干扰的第三阶段中切入入侵者DNA。 div>由于感兴趣的基因组中的PAM存在，这一削减是实现的（Kirchner＆Schneider，2015）