XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemCRRNA
CRISPR/RNPS- ...
结果：这项研究表明，土壤生长的叶子或愈伤组织衍生的胡椒原生质体是筛选有效的CRISPR/CAS9或CRISPR/CAS12A（CPF1）的有效指南RNA的有用系统。crispr/cas9或cpf1作为纯化的内切核酸酶的CRISPR/RNP复合物与设计的单个指南RNA混合在一起，可以编辑靶基因，camlo2，camlo2，在两个辣椒品种中，具有整个基因组测序，capsicum nuuum nuuum'cm334'和C. annuum'和annuum'dempsey'。在CM334和Dempsey和dempsey和Cleave Camlo2的体外，设计的Guide RNA（Cas9或CRRNA的SGRNA或CRRNA）在Camlo2中保守。crispr /cas9-或 /cpf1-RNP复合物被转染到热胡椒cm334的纯粹分离的原生质体中，并通过PEG介导的递送转染了甜辣椒dempsey。有针对性的深层测序分析表明，根据应用的CRISPR/RNP，在两个品种中都差异地编辑了靶向的Camlo2基因。
新型抗危机辅助CRISPR生物传感器，用于独家检测单链DNA（ssDNA）
摘要：核酸分析在疾病诊断和治疗中起重要作用。CRISPR技术的发现为检测核酸的检测提供了新颖而多功能的方法。但是，使用最广泛的CRISPR-CAS12A检测平台缺乏将单链DNA（ssDNA）与双链DNA（DSDNA）区分开的能力。为了克服这一局限性，我们首先采用了抗Crispr蛋白（ACRVA1）来开发一种新型的CRISPR生物传感器，以专门检测ssDNA。在这种传感策略中，ACRVA1切割CRISPR指南RNA（CRRNA）抑制CRISPR-CAS12A系统的裂解活性。只有ssDNA具有募集裂解的crRNA片段以恢复CRISPR-CAS12生物传感器的检测能力，但DSDNA无法实现这一目标。通过测量CRISPR-CAS12A生物传感器的回收裂解活性，我们开发的ACRVA1辅助CRISPR生物传感器能够将ssDNA与dsDNA区分开，为检测SSDNA的检测提供了一种简单可靠的方法。此外，我们证明了我们开发的ACRVA1辅助CRISPR生物传感器，以监测解旋酶的酶促活性并筛选其抑制剂。关键字：基于CRISPR的生物传感器，CAS12A（CPF1）核酸酶，抗Crispr蛋白，ACRVA1，单链DNA（SSDNA）
CRISPR/Cas 技术及其在大肠杆菌中的应用
大肠杆菌是生产生物燃料和大宗化学品（如乙醇、高级醇、脂肪酸、氨基酸、莽草酸衍生物、萜类化合物、聚酮化合物和聚合物前体（如 1,4-丁二醇））的最广泛使用的细胞工厂之一（Yang 等人，2021 年）。生产这些生化物质的代谢工程需要对细胞代谢进行大量调节以提高生产率。基因组编辑需要高效的工具来执行节省时间的顺序或多重操作。大肠杆菌有许多基因编辑工具，但它们都有特定的优点和缺点。使用双链 DNA（dsDNA）进行基因工程重组通常需要选择标记，这些标记应在下一步中被消除，以便进行后续修改（Datsenko 和 Wanner，2000 年；Sharan 等人，2009 年）。与双链DNA相比，单链DNA（ssDNA）介导的重组效率更高，并已进一步发展为可进行多重编辑的基因编辑工具，如多重自动基因组工程（MAGE）（Wang et al.，2009）和可追踪多重重组（TRMR）（Warner et al.，2010）。但这些方法不适用于没有选择标记的20bp以上的多个靶基因插入，通常需要强大的高通量筛选方法（Li et al.，2015）。近来发展的成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统被广泛应用于大肠杆菌的基因工程，极大地促进了其应用。成熟的 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 双链（或单个合成向导 RNA，sgRNA）或仅 crRNA 引导 Cas 核酸酶切割具有所需原型间隔区相邻基序 (PAM) 的靶 DNA 序列 (Jiang et al., 2013)。我们之前的文章 (Liu et al., 2020) 总结了不同类型的 CRISPR 系统的机制。CRISPR/Cas 系统持续切割靶位点，直到成功编辑或未编辑的细胞死亡，从而无需使用选择标记。
荧光 Cas9 mRNA 用于富集 CRISPR-...
图 2：使用荧光 Cas9 mRNA 富集基因敲除 A. 对与 mKate2 Cas9 mRNA 和阳性对照 PPIB crRNA:tracrRNA 共电穿孔并根据 mKate2 荧光进行分选的 K-562 细胞群进行错配检测分析。B. 在次优和最优脂质转染条件下，EGFP Cas9 mRNA 分选的 U2OS 细胞群的 FACS 数据。C. 对 EGFP Cas9 mRNA 分选的 U2OS 细胞群进行错配检测分析
CRISPR 及其在肢体再生中的潜在应用
CRISPR-Cas 是一种在细菌中普遍存在的适应性免疫机制。大约三十年前，它在大肠杆菌中被发现，随后在其他细菌和古细菌中也发现了它。CRISPR 代表成簇的规律间隔的短回文重复序列。它作为非同源间隔区之间的重复单元整合到细菌的 DNA 中，保护宿主免受外来元素的攻击。当受到外来遗传元素的攻击时，CRISPR-Cas 免疫系统被激活，其中 Cas 蛋白充当剪刀，将外来 DNA 切成较短的片段，然后作为间隔区整合到宿主 DNA 中。在细菌的防御系统中，当 Cas 蛋白与两种不同的 RNA 分子 CRISPR RNA (crRNA) 结合时，CRISPR-Cas 就会起作用，crRNA 会引导 Cas 酶到达 DNA 并切割 DNA，而反式激活 CRISPR RNA (tracr RNA) 会与 Cas 本身结合。此过程可确保识别外来基因的进一步攻击并保护宿主 [26][16]。CRISPR-Cas 系统是目前最可靠且应用最广泛的基因组编辑和工程机制。Cas 酶的变体 Cas9 是
Anti-CRISPR：噬菌体对抗细菌的防御策略
DOI：https://doi.org/10.22271/j.ento.2020.v8.i6n.7968 摘要 成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)-Cas 系统是一种序列特异性的适应性免疫策略，广泛存在于原核生物系统中，赋予针对各种噬菌体和其他 MGE（如质粒、基因组岛、整合和接合元件）的先天免疫力。即使存在如此复杂的机制，细菌也并非总是能完全战胜噬菌体。这是由于噬菌体和其他 MGE 产生的抗 CRISPR 蛋白。自 2013 年发现以来，迄今为止已鉴定出 60 多个 Acr 家族，还有更多家族尚待发现。研究揭示了 Acrs 采用的多种机制，通过这些机制介导对 CRISPR 防御系统的控制。随着该领域的发展，Acrs 可作为 CRISPR-Cas 技术的潜在控制策略。在本综述中，我们重点介绍了各种抗 CRISPR 蛋白的发现、它们对抗细菌 CRISPR-Cas 系统的作用机制，以及 Acrs 在基因编辑和基因治疗技术中的潜在应用。 关键词：抗 CRISPR、噬菌体、Cas 蛋白、CRISPR、基因组编辑 简介 噬菌体和细菌已经战争了数百万年，噬菌体控制着细菌种群的数量和组成。为了对抗来自噬菌体的这种持续威胁，细菌进化出了非常多样化的防御策略，将检查点设置在噬菌体生命周期的各个阶段。这包括阻断噬菌体附着、抑制 DNA 进入、开发限制-修饰系统、流产感染系统 (Abi) 和干扰噬菌体组装 [1] 。除了上述策略外，细菌还进化出了一种称为 CRISPR Cas 的序列特异性适应性免疫策略 [2] 。 CRISPR 阵列是有关先前感染细菌细胞的噬菌体的数据仓库。Cas 蛋白与 CRISPR 阵列一起构成了这种 RNA 引导的核酸酶复合物。宿主细胞借助称为原间隔区相邻部分 (PAM) 的短序列区分自身 DNA 和入侵的外来移动遗传元件的 DNA [3] 。作为适应性免疫的一部分，所有系统都通过三个主要阶段发挥作用：适应或间隔区获取、表达或生物发生以及干扰阶段。在第一阶段，Cas1-Cas2 复合物识别 PAM 并切除目标 DNA 的一小部分（称为原间隔区），然后将其作为间隔区序列整合到 CRISPR 基因座中。其他辅助因子（如 Cas4、Cas1、Csn2 和逆转录酶 (RT)）也可以参与获取阶段。在下一个阶段，CRISPR 基因座转录为单个前 crRNA，然后加工成成熟的 CRISPR RNA (crRNA) [4] 。每个 crRNA 包含部分侧翼重复序列和间隔序列。在干扰阶段，crRNA 与 Cas 蛋白一起被招募以形成核糖核蛋白复合物，该复合物继续在细胞中寻找与 crRNA 间隔序列的任何匹配。如果发现，则根据 CRISPR Cas 系统的类别，通过招募新蛋白质或在复合物本身内激活来启动核酸酶活性。CRISPR-Cas 系统分为两类、六种类型和 30 多个亚型 [5, 6, 7]。第 1 类 CRISPR Cas 系统包括 I、III 和 IV 型，并使用多亚基 Cas 效应分子形成级联复合物。而在第 2 类系统（II、V 和 VI 型）中，靶标识别、结合和切割功能由单个效应蛋白执行。由于这种高度多样化和高效的机制，CRISPR Cas 系统不仅可以保护细菌免受噬菌体的侵害，还可以保护细菌免受其他移动遗传元件 (MGE) 的侵害，如质粒、基因组岛、整合元件和接合元件 [8]。
针对 Cas9 表达细胞的 Edit-R 合成向导 RNA 转染方案
以下是使用 DharmaFECT™ 1-4 转染试剂（目录号 T-2001、T-2002、T-2003、T-2004）将合成向导 RNA 转染到表达 Cas9 的培养哺乳动物细胞中的简化方案。合成向导 RNA 可以是合成的单向导 RNA，也可以是与 tracrRNA 复合的合成 crRNA。适用于完成细胞系优化后使用。有关完整详细信息以及优化指南，请参阅技术手册。
CRISPR-CAS效应子的特异性和裂解位点确定噬菌体逃脱结果
au：PleaseconfirnheadingLevelsarerePresentedCorrected：CRISPR介导的干扰依赖于指导性CRISPR RNA（CRRNA）和靶核酸之间的互补性，以提供防御噬菌体的防御。噬菌体逃脱了基于CRISPR的免疫力，主要是通过邻接基序（PAM）和种子区域中的突变。然而，包括2类核酸内切酶Cas12a在内的CAS效应子的先前特异性研究表明，单个不匹配的耐受性很高。在噬菌体防御的背景下，尚未对这种不匹配公差的效果进行广泛的研究。在这里，我们测试了针对由Cas12a-CrrNA提供的lambda噬菌体的防御，该噬菌体含有含有先前存在的对基因组DNA中基因组靶标的不匹配。我们发现大多数先前存在的crrna不匹配导致噬菌体逃脱，无论在体外是否不匹配消融cas12a裂解。我们使用高通量测序来检查CRISPR挑战后噬菌体基因组的目标区域。在目标中的所有位置的不匹配均加速了突变噬菌体的出现，其中包括不匹配的不匹配，这些不匹配大大减慢了体外的裂解。出乎意料的是，我们的结果表明，PAM距离区域中存在的错误匹配导致目标的PAM-DISTAL区域中选择突变。体外裂解和噬菌体竞争分析表明，双Pam-Distal错误匹配比种子和Pam-Distal mis-grountes的组合要高得多，从而导致了这种选择。这些结果表明，CAS效应不匹配的耐受性，现有的靶标匹配和裂解位点强烈影响噬菌体的演变。但是，使用CAS9的类似实验并未导致PAM-DISTAL不匹配的出现，这表明切割位置的位置和随后的DNA修复可能会影响目标区域内逃生突变的位置。多种不匹配的CRRNA的表达阻止了新的突变在多个靶向位置产生，从而允许CAS12A不匹配的耐受性提供更强，更长期的protection。
基于CRISPR-CAS13A系统，为禽流感病毒建立快速的视觉检测方法
迅速，特定且敏感地检测禽流感病毒（AIV），这项研究建立了一种基于定期群散布的短palindromic重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白13A（Cas13a）的重组酶辅助扩增（RAA）的视觉检测方法。在这项研究中，根据AIV核蛋白（NP）基因的保守序列设计了特定的引物和CRRNA RNA（CRRNA）。raa技术用于放大目标序列，并通过侧流量尺（LFD）视觉检测到放大产物。评估了Raa-Crispr-Cas13a-lfd的特定峰，敏感性和可重复性。同时，使用该方法和聚合酶链反应（PCR） - 琼脂糖电泳方法检测临床样品，并计算了两种检测方法的重合速率。结果表明，RAA-CRISPR-CAS13A-LFD方法可以实现目标基因片段的特定扩增，并且可以通过LFD视觉观察到检测结果。同时，与感染性支气管炎病毒（IBV），传染性喉咙痛病毒（ILTV）和纽卡斯尔病毒病毒（NDV）没有交叉反应。灵敏度达到10 0拷贝/ µL，比PCR-琼脂糖电泳方法高1,000倍。临床测试的巧合率为98.75％，总反应时间约为1小时。在这项研究中建立的RAA-CRISPR-CAS13A-LFD方法具有快速，简单，强大的特异性和高灵敏度的优点，这为AIV检测提供了新的视觉方法。
CRISPR/Cas9 Selection 试剂盒产品说明书
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats) 是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其 他外源 DNA 的免疫机制。在该机制中， Cas 蛋白（ CRISP‐associated protein ）含有两个核酸酶结构域，可以 分别切割两条 DNA 链。一旦与 crRNA （ CRISPR RNA ）和 tracrRNA 结合形成复合物， Cas 蛋白中的核酸酶即 可对与复合物结合的 DNA 进行切割。切割后 DNA 双链断裂从而使入侵的外源 DNA 降解。